Biology

在体内肝细胞的分离纯化的肝细胞内吞其次是肝脏灌注

Published: November 10, 2011 doi: 10.3791/3138

Sandhya Gopalakrishnan¹, Edward N. Harris¹

¹Department of Biochemistry, University of Nebraska, Lincoln

Summary

从动物获得的无细胞系存在的主要细胞，肝窦内皮细胞（秒）的研究必须执行。这种方法依赖于肝的消化和差速离心SEC随后的培养和实验净化。

Abstract

肝脏是哺乳动物体内的代谢中心，并作为血液过滤器。肝脏的基本架构说明图1中，其中超过85％的肝脏肿块是由肝细胞和其余15％的细胞质量是枯否细胞（KCS），星状细胞（HSC）组成，正弦内皮细胞（秒）。 SECS形成肝脏内的血管壁，称为窗孔在细胞质内含有专门的形态。细胞质开窗孔的外观（〜100微米）的细胞内秒的行为，使筛子其中最乳糜微粒，乳糜微粒残余物和大分子，但不是细胞，通过向肝细胞和造血干^细胞 1（图1）。由于缺乏基底膜，SECS和肝细胞之间的差距Disse间隙。造血干细胞占据这个空间，并发挥了突出的作用，在调控和应对我njury，贮存维甲酸和免疫调节的肝^2。

SECS是身体endocytically最积极的显示阵列上其细胞表面^的 3的清道夫受体细胞。这些措施包括Stabilin SR - A - 1和Stabilin - 2。一般来说，小的胶体颗粒小于230纳米的大分子缓冲阶段秒，而，大颗粒和吞噬细胞碎片是由^KCS 4（吞噬）。因此，如从血液中糖胺外物质的散装间隙很大程度上取决于对健康^和 5,6秒内吞功能。例如，增加血液中的透明质酸水平是指示性的肝脏疾病，从轻微到更严重的^形式 7 。

随着一个报告⁸外，还有SEC存在没有永生细胞株。这永生细胞株，即使是去分化ated，它不表达清道夫受体（我们的数据，未显示）的主要SECS。所有细胞生物学的研究，必须从动物新鲜获得的原代细胞。不幸的是，SECS去分化标准培养条件下，必须在1或2天从动物隔离后使用。 Stabilin - 2的表达或野兔^受体 9，CD31，存在细胞质^开窗 1秒分化标记。除了血管内皮生长因子的培养基，或在肝细胞条件^培养基培养10,11细胞，可以延长秒分化。

在这份报告中，我们将展示完整的器官内吞活动的SECS使用无线电标记的肝素，透明质酸为美国证券交易委员会的具体Stabilin - 2受体。然后，我们将净化灌注肝脏的肝细胞和SECS来衡量的内吞作用。

Protocol

1。肝切除术（PO ^Seglen 12和R ^{Blomhoff 13} 14,15与修改通过）

添加10毫升30％的异氟醚聚乙二醇在一个封闭的5.5大号室培养皿中。等待10-15分钟后，异氟醚除了内室创造一个稳定的气氛，这是最佳。
老鼠放置在密封腔，并使其成为麻醉。麻醉的全面影响是显而易见的，当动物成为跛行，反应迟钝，和展品深呼吸。
放置2毫升异氟醚聚乙二醇在30 mL注射器管底部的一些棉球。
放在尿布覆盖的托盘，并将其放置在口鼻注射器管的大鼠在它的后面。
立即证实，用70％乙醇润湿腹部深麻醉。不要让动物死亡异氟醚过量。
使用绷带剪刀和镊子，揭露整个ABDominal腔。
找到腔PORTA，使用产钳，吸引两股的手术丝线或涤纶线（结扎）下腔以上肠系膜分支立即PORTA。
撤回镊子和领带一松上手结。
使用下面的腔PORTA钳轻轻拉了回来，以理顺静脉，cannulate Insyte Autoguard导管（1.3 GA，18 × 300毫米，BD公司）或类似的导管静脉。导管应超越由线程组成的环几个毫米。
缩回，删除通过导管释放弹簧加载触发针。血液应该开始渗入指示正确的结扎安置导管。
拧紧上手结和安全与另一上手结。
要么切断下腔静脉或降主动脉（主动脉abdominalis），让血液循环系统排出。
开始冲洗肝脏含氧TBS电视台在37 ° C，移除在20毫升/分钟的流速的血液（漂白）。肝脏变成一个壤土颜色从紫红色。
而肝脏是潮红，切除肝脏切掉消化道和结缔组织。重要的是不要划破Glisson囊肝或穿刺。
放置在超过一个漏斗，允许缓冲区来收集和再循环的塑料网肝脏。在这一点上的缓冲区不应再循环，但流入废物烧杯。法拉盛不应持续超过10分钟。（ 图2A）。准备步骤2.1所需的内吞作用的解决方案。

2。国际化¹²⁵ - SA - B - HEP（或其他适当的标记配体）

至50 ml的RPMI媒体在小烧杯中，加入终浓度为0.05％BSA和0.01 mCi的^{125 I} - SA - B - HEP或其他适当标记的配体的内吞作用。
将烧杯的apparatus到允许充氧。
关闭泵，开关入口管，然后打开泵在20毫升/分钟。
作为标记的RPMI方法肝脏，关闭泵，并让多余的液体在漏斗和油管漏。
媒体烧杯放入漏管允许再循环标记的媒体，然后重新启动泵。
让液体通过肝脏不超过1小时循环。
在此期间内化步骤，确保在肝脏的温度是通过覆盖它，并准备胶原酶消化稳定。

3。胶原酶消化肝脏消化

新鲜溶解并过滤（0.45微米）胶原酶（100毫克/公斤体重大鼠）应添加到缓冲区的总体积不超过60毫升，在37 ° C。量是依赖于管的长度/内部容积，应作相应调整。
停泵和交流从媒体烧杯的TBS入口管。
冲洗2分钟，在50 mL / min的钙依赖的桥粒细胞路口松动允许肝脏。
而肝脏是潮红，交流媒体烧杯中含有胶原酶烧杯仪器。
冲洗后，立即开始在流速为20 mL / min的长达15分钟的消化胶原酶在循环回路。由于胶原酶批次不同批号，在消化的数量和时间的变化，需要为每一个新的胶原酶很多优化。胶原酶也是钙依赖。关闭泵和切换缓冲区和天然气线从保温瓶一个合剂B.转移废物容器的污水合剂乙线（ 图2B）。
停泵，取下导管和肝脏转移到一盘菜含有20-30毫升缓冲1。
剥开Glisson囊肝和动摇的细胞出去了在液体中。
由于液体变为不透明的细胞物质，通过100微米过滤通过一个30微米网格，然后到50 mL锥形冰网格传输的细胞。
添加更多的缓冲区1到肝脏，并继续摇晃肝基质细胞，网状过滤器和锥形转移到液体。
重复步骤3.7至3.9，直到没有更多的细胞可以脱落合理的肝晃动。

4。肝细胞和SEC的净化

离心机50毫升含3分钟，在150 XG细胞conicals。颗粒的肝细胞。
转移包含非实质细胞，新鲜的50毫升冰conicals的液体部分。
洗肝resuspending在缓冲区3沉淀，并重复步骤4.1和4.2三次。
洗末，颗粒≥97％纯肝细胞。为了获得SECS，离心管C的所有ontaining池上清液在10分钟的200 XG（含造血干细胞，秒，以及KCS和一些小肝）。在4 ° C
吸缓冲区和4颗粒重新悬浮于5 mL的RPMI / BSA ° C。
池的细胞聚集成2管，并添加35毫升的体积的RPMI / BSA的最多。
离心3分钟，在100 XG conicals。
收集前25毫升的液体转移到一个干净的50 mL锥形。
重悬沉淀在余下的10毫升媒体，并添加25毫升冷的RPMI / BSA和离心3分钟，在100 XG。
再次重复步骤3.8和3.9，弃细胞沉淀和低10毫升媒体。
离心supernatents颗粒秒，KCS，造血干细胞在10分钟200 XG。在4 ° C
准备三个50毫升20毫升25％Percoll上冰的PBS管。底图与15毫升50％，每管Percoll。
在总体积为30 mL的RPMI / BSA重悬细胞沉淀。
仔细叠加选管会10毫升的细胞和离心20分钟，在900 XG h梯度在4 ° C
SECS和KCS有着非常密切的浮力密度和25/50％界面。造血干细胞通常在25％/媒体接口由于其较高的脂质储存细胞的浮力。任何剩余的肝细胞和血细胞降低buoyancies颗粒。吸从25/50％界面附近的自上而下和丢弃这种材料。
25/50％接口转移到与冷的RPMI新鲜锥形收集细胞。最终体积应〜40毫升，以稀释的Percoll。
锥形离心10分钟350 XG在4 ° C沉淀细胞。
〜10毫升预热RPMI酸洗玻璃培养皿中含有100 U /毫升Penicillin/100克/ ml链霉素和地方细胞或结晶盘重悬细胞。
孵育15分钟的细胞。在37 ° C，在一个组织文化的孵化器。
岩石或旋流板一点点然后收集上清SECS。 KCS坚持比秒更迅速地在玻璃上。此外，SECS可从KCS分隔，使用抗CD31或anti-Stabilin2/HARE抗体结合磁珠immunopurification。
台盼蓝排除使用hemacytometer或使用自动细胞计数器的生存能力和细胞数量可能被评定。
文化的SECS纤维连接蛋白涂层的塑料菜在37 ° _{C，5％CO 2，}与血管内皮生长因子为40毫微克/毫升，100 U / ml青霉素，100μg/ mL链霉素或牛血清白蛋白与肝细胞条件培养基RPMI/0.25 ％。
肝细胞，KCS和SECS标记材料的内化的可评估使用伽玛计数器和规范使用这些培养方法细胞总蛋白或显微镜（荧光标记）。

5。代表性的成果：

肝细胞净化≥97％和证券交易委员会的净化是表型盟友≥95％，使用这种方法。腹腔，门静脉插管，热烫的肝切除，都应该出现在一分钟内获得最佳效果。 HARE/Stabilin-2是对肝脏SECS的特异性受体，并不表示在其他类型的肝细胞。在此示例中，肝和SECS细胞裂解物5％的SDS - PAGE分离，并用单克隆抗体检测对Stabilin - 2两种异构体（ 图3） 。

普通肝素注入血液流是由肝脏清除^16。间隙是主要由肝脏SECS肝细胞和^KCS 17 。 Stabilin-2/HARE受体是主要清除受体结合和内化秒¹⁸的肝素。在我们的例子中，我们标记羧酸葡萄糖/ NS组与生物素标记的肝素。碘化链亲和素生物素是共轭化的肝素PROT检测eoglycan。，随后由放血标记的肝素注射，注射后30分钟，让我们监察机关内在这种形式的肝素。在这短短的时间间隔，肝的主要通关器官（ 图4）。

为了更清楚地了解细胞类型是负责清除，我们增加了^{125 I} - SA - B - HEP辅以0.05％BSA的RPMI媒体，并允许它通过肝脏循环20分钟。胶原酶消化和蜂窝净化，绝大多数标记肝素内肝细胞（ 图5）SECS。

图1基本的肝架构。 SECS的血窦形成的墙壁通常是孔（小群各界）。星状细胞（HSC）被发现在Disse间隙库普弗彗星英语学习者（KCS），它们通常存在于血窦微血管。肝Disse间隙中占有的另一边。

图2。灌注装置的示意图。一）设置设备在冲洗/洗肝血窦。 TBS是在1升容量瓶中。二）一个125〜60 ml缓冲液2 mL容量瓶中含有胶原酶用于消化肝脏，在一个封闭的电路。污水线也发生了变化，从废弃物容器，烧瓶乙通过削减橡胶瓶塞的缺口。氧行不浸入含胶原酶（乙烧瓶）的缓冲区，以避免起泡。在每个烧瓶塞子的缺口，让污水线的有效转移，以防止氧气的压力增加。

图3。

图4。标记在机关肝素分布。大鼠经尾静脉注射^{125 I} - SA - B - HEP等待30分钟，然后exsanguinated。采血，以便不给任何机关虚高读数。（CPM）的每一个器官，每分钟的计数正常化对器官的重量以克。

图5：在肝和SECS标记的肝素量。转速我媒体载有¹²⁵余SA - B - HEP被允许通过一个完整的肝胶原酶消化和蜂窝净化20分钟分发。等量的肝细胞和SEC细胞蛋白裂解物进行了量化与Bradford法和伽玛计数器计数。

图6。Kupffer细胞分离SECS粘附在玻璃上。细胞被放置在一个酸洗玻璃结晶菜，并坚持15分钟在37℃，5％的_CO 2 。含有非坚持细胞的上清轻轻众说纷纭，放在离心管。从玻璃上都坚持细胞（泳道1）非坚持细胞（泳道2）8％的SDS - PAGE分离裂解液，涂抹，并与抗体对CD163 Kupffer细胞的具体探讨。

纤维连接蛋白涂层的塑料上镀图 7秒6的菜肴孵育过夜，0.1％BSA的RPMI补充。（一）100X（二）200X放大倍率相位对比图像。

Discussion

麻醉大鼠悬滴法在异氟醚蒸气诱导昏迷，是我们研究的首选方法。一个蒸发器，也可能被用来代替注射器与棉花维持在会议厅外的动物，但手术过程中的那么快，它不是必需的。聚乙二醇添加到异氟醚，以减少蒸汽压力和蒸发速度。异氟醚蒸气太多太快会诱发死亡。如果动物死亡前肝脏是空心的，用TBS，血液可能汇集在肝脏血块烫一下，防止血窦和胶原酶消化高效清洗。肝素除可作为抗凝剂，但不是在这些研究中使用，因为我们用我们的探头标记的肝素。

Gey的缓冲盐溶液（GBSS）往往是取代其他实验室秒净化。虽然它是非常有用的SEC的净化，HEPatocytes不容忍GBSS以及缓冲器1-3和存活率都差不多高。当测量的内吞作用，这是很好的做法，措施，在机关和纯化的肝细胞的背景水平。

这种方法的二分之一以下胶原酶肝脏灌注SECS高效净化。另一种方法是由淘洗离心¹⁹ Percoll梯度分离非实质细胞。使用超过Percoll梯度淘洗的优点是稍高的细胞存活率和数字。的缺点是，淘洗离心需要一个专门的转子，专用离心机，蠕动泵成本几万块钱。这种方法只需要使用冷藏表离心机，蠕动泵，这是许多实验室的标准。

SECS和选择性粘附KCS的分离是一种标准的方法20日至22日。秒，将坚持以玻璃和塑料虽然这是事实，关键的一点是使用不超过15分钟的孵化酸冲洗干净玻璃，在37 ° C时，5％的CO _2。 KCS将始终坚持比秒的速度更快，最好是轻轻用媒体的KCS提取任何剩余的，已成为松散连接SECS。链霉蛋白酶和其他蛋白酶也省略了在本议定书中的胶原酶消化步骤，增加细胞的存活率。蛋白酶消化细胞外受体，并可能抑制细胞粘附在最后的纯化步骤。

这里介绍的方法具有广泛的应用。虽然我们显示肝素初步过关，获得原代肝细胞肝脏灌注的最终结果，KC，秒，造血干细胞可能是有用的研究，涉及的代谢途径，免疫调节，清道夫活动，及其他数生理studiES。在此过程中最困难的部分是良好的插管，消化，肝脏和肝脏的处理，而无需来自门静脉的导管滑。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

我们要感谢保罗威格尔在大学的博士。俄克拉何马州30单克隆抗体检测HARE/Stabilin-2受体和她的技术援助，珍妮特威格尔。这项研究是由内布拉斯加大学研究基金资助。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer 1: 142 mM NaCl 6.7 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.5% BSA, pH 7.4 Buffer 2 (perfusion buffer): 67.0 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 4.8 mM CaCl₂-H2O, 101.0 mM HEPES, BSA 1.5%, pH 7.4. Buffer 3: 137 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.7 mM MgSO₄, 1.2 mM CaCl₂-2H₂O, 10 mM HEPES, 1.5% BSA, pH 7.4 RPMI/BSA: 15g/L BSA in RPMI TRIS-buffered Saline (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM Trizma Base salt. Collagenase: Collagenase A (#11088785103) from Roche, Collagenase Type I (#LS004691) from Worthington Biochemical or Collagenase I (#C0130) or IA (#C9891) from Sigma-Aldrich.
All salts are from Sigma-Aldrich
20L water bath	ThermoFisher	2231	Water is about 45 °C to compensate for cooling within the tubing.
Peristaltic Pump	Cole-Parmer	7553-70	Masterflex series
Refrigerated Centrifuge	Sorvall	Legend XTR
Catheter	BD Biosciences	381444
Dessicator chamber	Fisher	08595E	Use internal plate
Percoll	Sigma	P4937
Bovine Serum Albumin	SeraCare	AP-4510-01
100 μm mesh	Spectrum labs	146488
30 μm mesh	Spectrum labs	146506
RPMI 1640	Invitrogen	21870
Polyethylene glycol	Spectrum labs	PO107