Undersøgelsen af lever sinusformet endotelceller (sek) skal udføres med primære celler udtaget fra dyret, da der ikke cellelinjer eksisterer. Denne metode bygger på leveren fordøjelsen og differential centrifugering for SEC rensning for efterfølgende dyrkning og eksperimenter.
Leveren er det metaboliske midten af pattedyr kroppen og fungerer som et filter for blodet. Den grundlæggende arkitektur leveren er illustreret i figur 1, hvor mere end 85% af leveren masse består af hepatocytter og de resterende 15% af den cellulære massen er sammensat af Kupffer celler (KCS), stellate celler (HSCs), og sinusformet endotelceller (sek). Sek danne blodkarrenes vægge i leveren og indeholder specialiserede morfologi kaldet fenestrae inden i cytoplasmaet. Facadeentreprenør af cytoplasma, er forekomsten af huller (~ 100 mM) i cellerne, så Sek fungere som en si, hvor de fleste chylomikroner, chylomicron rester og makromolekyler, men ikke cellerne, passere til hepatocytter og HSCs 1 (Fig. 1). På grund af manglen på en basalmembran, kløften mellem sekunder og hepatocytter danner rum for These. HSCs besætte denne plads og spille en fremtrædende rolle i regulering og reaktion injury, opbevaring af retinsyre og immunoregulation i leveren 2.
Sek er blandt de mest endocytically aktive celler i kroppen vise en bred vifte af scavenger receptorer på deres celle overfladen 3. Disse omfatter SR-A, Stabilin-1 og Stabilin-2. Generelt er små kolloide partikler mindre end 230 nm og makromolekyler i buffer fase taget op af Sek, henviser til, at store partikler og celleaffald endocytose (fagocytose) ved KCS 4. Således er hovedparten clearance af ekstracellulære materiale såsom glycosaminoglycaner fra blod er i vid udstrækning afhængig af sundheden og endocytic funktioner sek 5,6. For eksempel er en stigning i blodets hyaluronan niveauer tyder på leversygdom spænder fra milde til mere alvorlige former 7.
Med undtagelse af en enkelt rapport 8, er der ingen udødeliggjort SEK cellelinjer i eksistens. Selv denne udødeliggjort cellelinie er de-differentieretolereres i, at det ikke udtrykker scavenger receptorer, der er til stede på den primære sek (vores data ikke vist). Alle cellebiologiske undersøgelser skal udføres på den primære celler udtaget frisk fra dyret. Desværre sek dedifferentiate under standard dyrkningsbetingelser og skal bruges inden for 1 eller 2 dage efter isoleret fra dyret. Differentiering af Sek er præget af udtryk for Stabilin-2 eller hare receptor 9, CD31, og tilstedeværelsen af cytoplasmiske vindues 1. Differentiering af sekunder kan udvides ved tilføjelse af VEGF i kultur, medier eller ved dyrkning af celler i hepatocyt konditioneret medium 10,11.
I denne rapport vil vi demonstrere endocytic aktivitet sekunder i den intakte orgel ved hjælp af radio-mærket heparin for hyaluronan for SEC-specifikke Stabilin-2 receptoren. Vi vil derefter rense hepatocytter og sek fra den perfunderet leveren til at måle endocytose.
Bedøvelse af rotte ved hængning slip-metoden, hvor isofluran damp inducerer bevidstløshed er den foretrukne metode for vores studier. En vaporizer kan også anvendes i stedet for en sprøjte med bomuld for at bevare dyret uden for mødesalen, men de kirurgiske procedurer er så hurtig, det er ikke påkrævet. Polyethylenglycol føjes til isofluran at sænke damptrykket og fordampningshastighed. For meget isofluran dampe vil medføre døden for hurtigt. Hvis dyret dør, før leveren er kanylerede og blancheret med TBS, pooling blod kan koagulere i leveren og forhindre en effektiv vask af sinusoider og fordøjelse med collagenase. Tilføjelsen af heparin kan være nyttig som en antikoagulans, men er ikke anvendt i disse undersøgelser, da vi anvender mærket heparin som vores sonde.
Gey er bufferet saltvandsopløsning (GBSS) er ofte erstattes af andre laboratorier til rensning af sek. Selv om det er nyttigt for SEC rensning, HEPatocytes tolererer ikke GBSS samt Buffere 1-3 og viabilities er ikke nær så høj. Ved måling af endocytose, er det god praksis at måle baggrundsniveauer i orglet og i renset hepatocytter.
Denne metode er en af to til effektiv rensning af sekunder efter leveren perfusion med collagenase. Den anden metode adskiller non-parenkymceller ved elutriation centrifugering 19 i stedet for Percoll gradient. Fordelene for brug af elutriation end Percoll gradienter er en anelse højere celle viabilities og tal. Ulempen er, at elutriation centrifugering kræver en specialiseret rotor, dedikeret centrifuge, og peristaltisk pumpe sammen som koster titusindvis af dollars. Denne metode kræver kun brug af en nedkølet bordplade centrifuge og peristaltisk pumpe, som er standard i mange laboratorier.
Adskillelse af sekunder og KCS ved selektiv vedhæftning er en standard metode20-22. Selv om det er sandt, at Sek vil holde sig til glas og plastik, det afgørende punkt er at bruge syre-vasket rene glas med ikke mere end en 15 minutters inkubation ved 37 ° C ved 5% CO 2. KCS vil altid holde sig hurtigere end sekunder og det er tilrådeligt at forsigtigt vaske KCS med medierne for at udvinde eventuelle resterende sek, der er blevet løst tilknyttet. Pronase og andre proteaser er også udeladt fra collagenase fordøjelsen skridt i denne protokol for at øge viabilities af cellerne. Proteaser fordøje ekstracellulære receptorer og kan hæmme cellulær vedhæftning i den endelige rensning skridt.
Metoden præsenteres her har en bred vifte af applikationer. Selvom vi viser det endelige resultat, hvor heparin i første omgang taget op til clearance, perfusion af leveren for at opnå primære hepatocytter, kan KC, Sek, og HSCs være nyttigt for en række undersøgelser med metaboliske veje, immunoregulation, ådselsæder aktiviteter og andre fysiologiske Studies. Den sværeste del af denne procedure er god kanylering, fordøjelsen af leveren, og håndtering af leveren uden at have kateteret glide fra portalen vene.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. Paul Weigel ved Univ.. i Oklahoma for brug af monoklonale antistof 30 for påvisning af HARE/Stabilin-2 receptoren og Janet Weigel for hendes teknisk bistand. Denne forskning er finansieret af University of Nebraska forskningsmidler.
All salts are from Sigma-Aldrich
Name | Company | Model/catalog # | Comment |
20L water bath | ThermoFisher | 2231 | Water is about 45°C to compensate for cooling within the tubing. |
Peristaltic Pump | Cole-Parmer | 7553-70 | Masterflex series |
Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend XTR | |
Catheter | BD Biosciences | 381444 | |
Dessicator chamber | Fisher | 08595E | Use internal plate |
Percoll | Sigma | P4937 | |
Bovine Serum Albumin | SeraCare | AP-4510-01 | |
100 μm mesh | Spectrum labs | 146488 | |
30 μm mesh | Spectrum labs | 146506 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
Polyethylene glycol | Spectrum labs | PO107 |