Summary
Assay תלת מימדי המאפשר clonogenic הלבלב כמו אבות להתמיין אינסולין להביע המושבות מתואר. שיטה זו מנצלת חצי מוצק מדיה המכילה גורמים, methylcellulose Matrigel וצמיחה, שבו אבות יחיד להתרבות ולהבחין
Abstract
השדה של גזע הלבלב ביולוגיה של התא ובתאים כבר הקשו על ידי חוסר ב מבחני חוץ גופית פונקציונלי כמותיים המאפשרים ניתוח של התא הבודד. ניתוח של אבות חד הם בעלי חשיבות קריטית משום שהן מספקות דרכים סופי חד משמעי להדגים את הפוטנציאל של אבות השושלת בודדים. למרות שיטות כבר המציאו כדי לייצר "pancreatospheres" בתרבות ההשעיה מתאי יחיד, מספר מגבלות קיימות. ראשית, זה זמן רב לבצע בתצהיר תא בודד עבור מספר גדול של תאים, אשר פקודות להפוך כמויות גדולות של מדיה תרבות ומרחב. ספרור שנית, של pancreatospheres המתקבל הוא עתיר עבודה, במיוחד כאשר התדירות של pancreatosphere-ליזום אבות נמוכה. שלישית, assay pancreatosphere אינה שיטה יעילה כדי לאפשר הן את התרבות והתמיינות של אבות הלבלב בתרבות אותו היטב, מחדשstricting את השימושיות של assay.
כדי להתגבר על המגבלות האלה, חצי מוצק מדיה assay מושבה המבוססת על אבות הלבלב פותחה והוא מוצג בדוח זה. שיטה זו מנצלת את המושג קיים מ assay המושבה hematopoietic, שבו methylcellulose משמש כדי לספק צמיגות לתקשורת, המאפשר ובתאים להישאר במרחב תלת מימדי כפי שהם עוברים שגשוג כמו גם בידול. כדי להעשיר את האינסולין להביע המושבה יוצרי אבות מתוך אוכלוסייה הטרוגנית, אנו מנוצלים תאים המבטאים neurogenin (NGN) 3, האנדוקרינית הלבלב אבי סמן התא. Murine גזע עובריים (ES) תאים שמקורם בתאי Ngn3 להביע מתוייגים עם הכתב חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת מוינו רבים כמו גם לכל 25,000 תאים היו מצופה לתוך קובץ מצורף נמוך של 24 מנות גם תרבות. כל אחד הכיל גם 500 μL של חצי מוצק התקשורת ביחד עם הרכיבים העיקריים הבאים: פגשhylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin βB, והתקשורת מותנה שנאספו תאים שמקורם בתאי הלבלב כמו Murine ES. לאחר 8-12 ימים של תרבות, אינסולין להביע מושבות עם מורפולוגיה ייחודית נוצרו יכול להיות מנותח נוספת לביטוי הלבלב גן כמותי באמצעות RT-PCR ו מכתים immunoflourescent כדי לקבוע את ההרכב שושלת היוחסין של כל המושבה.
לסיכום, assay המושבה שלנו מאפשרת זיהוי קל וכימות של אבות פונקציונלי בתוך אוכלוסיה הטרוגנית של תאים. בנוסף, פורמט חצי מוצק התקשורת מאפשר הצגה אחידה של מרכיבי תאי מטריקס ו - גורמי גדילה לתאים, המאפשר אבות להתרבות להבדיל במבחנה. זה assay המושבה מספקת הזדמנויות ייחודיות עבור מחקרים מכניסטית של ובתאים הלבלב ברמת תא בודד.
Protocol
1. התמיינות של תאים עובריים Murine על הלבלב כמו תאים במבחנה ליצור מדיה מותנית (CM) עבור assay המושבה
נוהלי תחזוקה ES Murine התא, embryoid (EB) היווצרות הגוף בתרבות ההשעיה, תרבות מצורף עבור בידול נוסף תוארו בעבר 1-3 והם אינם במוקד דו"ח זה. מצגת סכמטי של המעורבים פרוטוקול הבידול שלנו הוא שמוצג באיור 1.
על מנת לקבל איכות גבוהה התקשורת מזגן, חשוב קודם כל ליצור 6-EBS בן יומו שבו לפחות 30-40% מהם הם עם קוטר של לפחות 150 מיקרומטר. EBS גדול צריך להכיל כתמים כהים תחת מיקרוסקופ אור, דבר המצביע על בידול משופרת (איור 2). מבחר גבוה העובר איכות עגל בסרום (FCS) הוא קריטי כדי להפיק EBS כאלה. איכות גבוהה הרבה FCS נבחרו על בסיס יכולתם לתמוך differentiatיון של EBS לקראת 1 אינסולין, גלוקגון ו - גן עמילאז 2A ביטוי בשלבים מאוחרים יותר (18-20 יום), זוהה על ידי ניתוח RT-PCR. יתר על כן, כאשר יום-6 EBS מועברים מתרבות לתרבות ההשעיה מצורף (כ 80-100 EBS לכל טוב 6 צלחות טוב) חשוב לסובב בעדינות את הצלחות לאסוף את יום-6 EBS למרכז בארות. מסיבות, תמרונים לא ידוע המשפרים תאים תאים קשר לגרום להתפתחות טובה יותר של הלבלב דמויי תאים EBS את השלב שלאחר מכן מצורף תרבות.
- ביום התרבות 13, להחליף את התרבות מצורף מדיה (DMEM/F-12 (1:1), החלפת בנוקאאוט 15% נסיוב, 2 מ"מ L-גלוטמין, 50 U / mL פניצילין, 50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין) עם תרבות מצורף טרי התקשורת containing10 nicotinamide מ"מ, 0.1 nM exendin-4, ו 10 ng / mL אנושי רקומביננטי activin SSB (ריכוז כל הסופי).
- ביום התרבות 16, לאסוף את המדיה צעד 1.1 ולסנן אותה דרך polyethers 0.2 מיקרומטרulfone הממברנה. מכאן ואילך התקשורת ייאספו המכונה בתקשורת מותנה (CM). Aliquot 15 ס"מ לתוך צינורות מ"ל פלקון ולאחסן אותו ב -80 ° C עד לפני רק לתרבות חצי מוצק (ראה סעיף 3 להלן).
2. קבלת הלבלב כמו אבות ההשעיה תא בודד באמצעות סדרן הקרינה התא הפעיל
עקום בקו ES Murine התא, 4 כאזור Ngn3-EGFP, שם כתב את הגן EGFP החליף אלל אחד של מוקד Ngn3 היה מובחן כפי שתואר לעיל. 2 Ngn3 הוא גורם הסליל לולאה, סליל (bHLH) המכיל בסיסי שעתוק . הביע האנדוקרינית במהלך התפתחות הלבלב אבות יום 5-16 תרבויות מוינו בדרך כלל כדי להשיג בידול Ngn3-EGFP + ו-Ngn3 EGFP -. בתאים 1,2
- דיסוציאציה התמיינות של תאים לתוך ההשעיה תא בודד.
- יום דגירה-16 תרבויות wiה 0.25% טריפסין-EDTA (3 דקות, 37 ° C) כדי לסלק את התאים מבארות תרבות.
- הוסף 10% FCS להפסיק פעילות טריפסין.
- שטפו תאים עם מגנזיום סידן ללא פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) המכיל 0.1% אלבומין בסרום שור (BSA), ועל צנטריפוגות ב XG 300 דקות 5.
- הסר supernatant ו דגירה גושי תאים עם 4 מ"ג / מ"ל collagenase B ו 2000 U / mL deoxyribonuclease (DNase) אני (30 דקות, 37 ° C) כדי לייצר ההשעיה תא בודד. השתמש פיפטה 1000 μL לשבש את כדורי כל תא 10 דקות כדי לזרז את תהליך הניתוק.
- שטפו תאים עם PBS המכיל BSA 0.1%, ו צנטריפוגות ב XG 300 דקות 5.
- הסר supernatant ו resuspend התאים PBS המכיל BSA 0.1%.
- הכנת תאים למיון.
- הוסף 2 μL DNase אני (1 MU / mL) להשעיה כל תא מ"ל כדי למנוע reaggregation התא במהלך המיון.
- לעבור את ההשעיה תא בודד דרך מ 40-70 מיקרומטראש כדי להסיר אגרגטים תא גדול.
- הוסף DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל ריכוז סופי) כדי ההשעיה תא בודד.
- רוכשת cytometry זרימת נתונים על סדרן תא. MLS MoFlo (Beckman Coulter) סדרן תא שימש בדוח זה.
- Gating של אוכלוסיות תאים למיון. Ngn3-EGFP + ו-Ngn3 EGFP - תאים מגודרת הראשון עם פיזור קדימה לעומת פיזור בצד (איור 3A), ואחריו DAPI לעומת פיזור בצד (איור 3B), רוחב הדופק לעומת פיזור בצד (איור 3 ג), ולבסוף FL1 לעומת פלואורסצנציה אוטומטי (איור 3D). השער מיון סופי של Ngn3-EGFP + תאים מועבר בכוונה ימינה (איור 3E; חץ), במטרה לצמצם זיהום Ngn3-EGFP - תאים במהלך המיון. עבור gating שליטה שלילית, בין אם מתוך Ngn3-EGFP קו ES או לשלב אותו, היום 16 תרבות מן השורה שאינו מהונדס, כגון תאים TL1 ES (איור 3D, פאנל משמאל), יכול לשמש יום-6 EBS.
- מיין Ngn3-EGFP + ו-Ngn3 EGFP
3. ציפוי תאים ממוינים לתרבות מוצקים למחצה
- Matrigel הכנה.
- Matrigel Aliquot ל 1 מ"ל לכל צינור ולאחסן ב -20 ° C לפני השימוש.
- Aliquots קפוא צריך להיות ממוקם על 4 מעלות צלזיוס או על קרח בן לילה במשך 3 שעות רק כדי להפשיר לפני השימוש. Aliquots מופשר חייב להישאר על הקרח במהלך הכנת מוצקים למחצה תרבות להימנע resolidification.
- פתרון Methylcellulose (3.3%) הכנה.
אבקת Methylcellulose לא ניתן autoclaved. על מנת לקבל חיידקים ללא פתרון methylcellulose, להשתמש בסירות במשקל נקי ברים ומערבבים autoclaved, כוסות, צלוחיות ורכיבי חומרה אחרים במהלך תהליך ההכנה.- יום אחד לפני הכנת פתרון methylcellulose, 200 מ"ל לאחסן מים מזוקקים סטריליים כפול 4 ° C. כמו כן, להכין 500 מ"ל של 2x DMEM/F12 מדיה (מכינים על ידי המסת אבקת DMEM / F-12 ב הוכפל מים מזוקקים) המכיל 100 U / mL פניצילין100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ולאחסן ב 4 ° C.
- ביום של התכשיר methylcellulose, מוסיפים 500 מ"ל מים מזוקקים סטרילית כפולה כוס זכוכית 1000 מ"ל עם חתיכת נייר אלומיניום על גבי. מרתיחים במשך דקה לפחות 30 כדי לפטור את המים של בועות אוויר.
- המקום בר גדול ומערבבים בגודל (לפחות 3 ס"מ אורך) אל תוך בקבוק זכוכית 2000 מ"ל.
- מדד 300 מ"ל מים רותחים ולהעביר אותו הבקבוק.
- מניחים את הבקבוק על צלחת מערבבים (ללא חימום). לאט לאט לבחוש את המים החמים, כדי למנוע יצירת בועות אוויר.
- שקול 33 גרם של אבקה methylcellulose ולאט לאט להוסיף את המים החמים. מים חמים יש צורך להרטיב את האבקה methylcellulose ביעילות הסיוע בעקבות פירוק בטמפרטורה קרה.
- ממשיכים לערבב את האבקה עד שהטמפרטורה יורדת בכ 40-45 ° C.
- מוסיפים 200 מ"ל מים קרים סטרילי מזוקק כפול לתערובת methylcellulose קירור. מידלאחר מכן, אתה צריך להתחיל לראות את הפתרון להפוך שקופה צמיגה, דבר המצביע methylcellulose כי היא מתמוססת לתוך השלב מימית. מערבולת יד את הבקבוק על מנת להבטיח את הפתרון הוא מעורב באופן יסודי.
- מוסיפים 500 מ"ל קר 2x DMEM/F12 התקשורת. ממשיכים לערבל ביד לערבב.
- מניחים את הבקבוק על צלחת ומערבבים בחדר קר, ולאט לאט ומערבבים הפתרון methylcellulose עבור 24-48 שעות.
- Aliquot הפתרון לתוך 125 מ"ל לבקבוק אחסון, לאחסן ב -20 ° C. מדגם צריך לוותר לתוך petridish סטרילית והושמו 37 ° C חממה לבדוק עקרות. פתרון methylcellulose מופשר ניתן לשמור במקרר עד 2 חודשים.
- הכנה התקשורת אילף.
CM הפשירי (ראה סעיף 1) רק לפני השימוש. שמור את CM על הקרח ברחבי הכנה מוצקים למחצה תרבות. - הכן את גורמי גדילה הבאים: 1.0 M nicotinamide, 0.1 מיקרומטר exendin-4, 10 מיקרוגרם / מ"ל אנושי רקומביננטי activin βB, ו 10 & mu, g / mL VEGF-A. חנות nicotinamide ו exendin-4 ב -20 ° C ו activin βB ו VEGF-A ב -80 ° C, ו להפשיר אותם מיד לפני השימוש. חצי מוצק כל רכיבי התקשורת בתרבות יש לשמור על הקרח במהלך ציפוי. יצוין כי תוספת של VEGF-A נמצאה מאוחר יותר לא הכרחי להקמת המושבה. 2
- עגל הכנה עוברית בסרום. FCS יש חום מומת לפני השימוש. דגירה FCS למשך 30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס באמבט מים כדי להשבית החלבונים משלימים. אם את הבקבוק המניות הראשוני FCS מחזיקה יותר מ 500 מ"ל aliquot אותו לתוך צלוחיות 125 מ"ל. שטח הפנים גדל יבטיח חימום אפילו וממצה של כל נפח. אפשר הבקבוקים להתקרר בטמפרטורת החדר במשך שעה לפחות 1 לפני אחסון ב -20 ° C. FCS מופשר מסונן 0.2μm לפני השימוש.
- מערבבים את מרכיבי התרבות עם תאים ממוינים.
שמור את התאים כל חצי מוצק רכיבי התקשורת על הקרח במהלך הכנת בכל עת כדי למנוע התמצקות שלMatrigel. כל ציוד אשר באים במגע עם Matrigel כולל, טיפים פיפטה, מזרקים ומחטים, צריך להיות קר. מקום אלה מספקת בשעה -20 ° C לפחות מחצית לפני השימוש.- קבע את כמות התאים להיות seeded היטב לכל צלחת 24 באר. עד 25,000 תאים יכול להיות מצופה ל 24 גם כן. אפשר לבצע טיטרציה של צפיפות התאים בניסויים הראשונים כדי לקבוע את המספר האופטימלי תא זריעה.
- מוסיפים את מרכיבי התרבות לצינור קלקר 5 מ"ל עם מכסה לצלם ברצף שמתואר בטבלה 1 (לציין כי תאים מתווספים האחרון, כדי למנוע גירוי מוקדמת). מוסיפים את methylcellulose 3.3% ל הצינורות פוליסטירן הראשון התאים מיון האחרונים. שים לב כי הפתרון methylcellulose 3.3% צריך להיות משוכות והוסיף צינורות קלקר עם מחט מד ½ 16 ו מזרק סיים מסומן כראוי. באופן כללי, על מנת למדוד בצורה נכונה את עוצמת הקול של פתרונות צמיגה, כמו 3.3% methylcellulose סולution ואת תערובת תרבות הסופי, חשוב לשאוב כמה פתרון המזרק הראשון, ולאחר מכן מיד לדחוף את הפתרון כדי לגרש את האוויר. הפתרון methylcellulose 3.3% עשוי להיות מחומם לטמפרטורת החדר אם הוא קשה מדי להוציא. עם זאת, להבטיח שהוא מקורר על קרח אחרי זה הוא חילק לתוך צינורות פוליסטירן ולפני תוספת של Matrigel.
- צלחת חצי מוצק מדיה המכיל תאים ממוינים.
- לאחר הבטחת כמוסות של צינורות קלקר הן במקומו, לנער את הצינורות על ידי ידיים במרץ וביסודיות. בועות האוויר יופק במהלך תהליך זה.
- מניחים את הצינורות על קרח דק 5 או עד פני השטח בועות אוויר קטנות.
- השתמש מזרק עם מחט 1mL ½-16 מד ½ או 18 כדי לשאוב את תוכנו. בצע את העצות 3.6.2 לצייר נפח מדויק של פתרון צמיג ללא אוויר מזרקים.
- לאט לאט לוותר על 500 UL של מדיה לתוך כל 24 גם כן. להשתמשאת הקובץ המצורף נמוך 24 גם הצלחות בלבד. מוסיפים את המדיה ישירות למרכז הבאר. חצי מוצק מדיה באופן אוטומטי פרושים בבארות. עבור כל מדגם ניסיוני, בארות quadruplicated משמשים באופן שגרתי על מנת לקבל תוצאות מובהקות סטטיסטית. רק 4 העמודים הפנימיים של צלחת 24 גם בכיוון אופקי משמשים תרבות. מלאו את הבארות הנותרות עם מים סטריליים כדי לסייע humidification של התרבות התא המכיל את.
- דגירה התאים 37 ° C ו 5% 2 CO באוויר.
- עיכוב נוסף של גורמי גדילה. ניתן להוסיף גורמי גדילה לאחר תחילת התרבות. תמרונים אלה עשויים לשמש כתובת ההשפעות ההישרדות של גורמי גדילה מסויימים. גורם צמיחה פתרונות עד μL 100 גם יכול להיות נטף באמצעות מזרק 1 מ"ל עם 26 G 08/03 המחט מותר מפוזר לתוך חצי מוצק מדיה.
4. התבוננות במבנה המושבה תחת מיקרו אורלהתמודד
תאים יש לשים לב מיד לאחר ציפוי על מנת להבטיח כי תאים בודדים הם באופן אקראי מופץ באופן שווה ברחבי את הבארות. אם רוב התאים או במושבות כתוצאה מופצים בשוליים של הבארות, זו עולה כי מחלק חצי מוצק מדיה לתוך הבארות היה חזק מדי (ראה סעיף 3.7.4). בשל צפיפות השפעה מושבה המניסקוס בשולי בארות התרבות עשוי להיות גבוה יותר בהשוואה לאלה המתגוררים במרכז.
- מספר המושבה כימות. בשל תכונה 3 מימדי של התקשורת, המושבות יופיעו מוקדים שונים. לפיכך, התאמה של המוקד עבור כל המושבה ייתכן שתידרש במהלך התצפית על ידי מיקרוסקופ אור. צרף רשת תחת 24 גם כאשר ספירת על מנת למנוע רישום המושבה פעמיים. ברשת ניתן להשיג על ידי חיתוך של הקיר petridish NUNC (קט No.169558). העדשה אובייקטיבי 10x על מיקרוסקופ אור יש להשתמש כדי observe ולספור המושבות.
5. נציג תוצאות:
ניסויים קודמים הראו כי החל 2.5 x 10 5 תאים Murine ES R1 (בסך הכל 50 כלי התקשורת מ"ל) אפשר לצפות להפיק כ 5000 מתאים בגודל יום-6 EBS. Ngn3-EGFP תאים ES היו פחות יעיל; תאים 4 פעמים יותר נדרשו ליצור בגודל דומה EBS יום 6. בגלל 25 יום-6 EBS מכילים בממוצע 1.88 ± 0.67 x 10 5 תאים, 1 כ 37.6 x 10 6 תאים ניתן לקבל EBS 5000. במהלך התרבות התאים מצורף צפויים להרחיב 2.72 ± 0.32 לקפל. 1 לפיכך, 5000 יום 6 EBS תניב כ 100 x 10 6 תאים 16 יום לפני המיון. לאחר gating, Ngn3-EGFP תאים + ירכיבו כ -10% מהאוכלוסייה יום-16 תא הכולל (סעיף 2.2.5 פרוטוקול טקסט ואיור 3).
דוגמה photomicrographs של אינסולין להביע מושבות שמקורם בתאי גזע עובריים Murine מוצגת באיור 4. מושבות אלה יש מורפולוגיה ייחודית; קטן (~ 6-10 מיקרומטר) מושבות עגולה עם תאים בודדים במושבות כי הם קטנים, כהים, לא אור רעיוני. בפרסום הקודם שלנו, חשפה 2 בזמן אמת RT-PCR ו מכתים immunofluorescent כפולה של מושבות בנפרד הרים יד הביטוי של אינסולין, C-peptide ו גלוקגון. תוצאות אלו מראות את היכולת של יחיד Ngn3-EGFP + לתאים להתמיין לתאי המכילים לפחות שני הורמונים איון בו זמנית, בדומה לגל הראשון פרימיטיבי כמו תאים האנדוקרינית.
Assay מושבה עבור תאים בודדים מפוזרים מאפשר ללמוד אותם אבות שיש להם את היכולת ליזום התפשטות והבחנה במבחנה (איור 5). לפיכך, זהו assay כי ניתן למדוד את הפונקציה הפנימית של ובתאים נפרדים. אבות שיש להם את capability להפוך אינסולין להביע מושבות מכונים אינסולין להביע יחידות המושבה להרכיב (ICFUs) (איור 5). עקבי לרעיון Ngn3 סימני ובתאים אנדוקריני בלבלב בפיתוח, 5 Ngn3-EGFP +, אבל לא Ngn3-EGFP -. MES תאים תאים שמקורם באוכלוסיות מועשרים עבור ICFUs 2 עם זאת, התדירות של אבות אלה עדיין נמוך, כ 0.1% עד 0.6% מכלל האוכלוסייה + Ngn3-EGFP מבודד תרבות יום 16 הם ICFUs 2 בכל מקרה, הבדל ברור יעילות מושבה יוצרי צפוי, עם Ngn3-EGFP + תאים הגבוהה ביותר, ואחריה. תאים presorted, ואז Ngn3-EGFP - תאים.
באיור 1. ציר הזמן של בידול בתוך תאים במבחנה ES Murine אל הלבלב, כמו בתאים. במשך דור (CM) מדיה מזגן, Murine ES cells מגדלים ההשעיה עם FCS 15% בששת הימים הראשונים עם מינונים ירידה של monothioglycerol (6.0 x 10 -3 M עבור היומיים הראשונים ו 6.0 x 10 -4 M במשך ארבעת הימים הבאים) ליצור EBS. יום-6 EBS (80-100 דולר היטב) מועברים לאחר מכן מצורף 6-גם מנות המכילות 15% נוקאאוט החלפת בסרום. 5% FCS ניתן להוסיף בין 60-10 ימים של תרבות לזרז את הקובץ המצורף של EBS. Nicotinamide, exendin-4 ו activin אנושי רקומביננטי βB מתווספים אז לכלי התקשורת ביום תרבות 13 (ראה סעיף 1.1). מדיה נאסף ביום 16 תרבות ובשלב זה הפכה התקשורת מותנה. יום 16 תאים ממוינים ואז מצופה לתוך חצי מוצק מדיה assay המושבה.
באיור 2. Photomicrograph נציג של גופים יום-6 embryoid גדול הנגזר Murine בתאי גזע עובריים. יום אידיאלי-6 EBS לפחות 150 מיקרומטר קוטרeter יש מרכזים חשוך (חיצים). ביטוי מוקדם של אבי סמני הלבלב (כגון PDX-1 ו Sox9) מוגברת אלה EBS (מידע לא מוצג) 3.
באיור 3. מיון השערים MES תא הנגזרות יום Ngn3-16-EGFP תאים להביע. (א) שערי פיזור פורוורד לצד, מעיד על גודל התא גרעיניות בהתאמה, לחסל הלא הסלולר פסולת. (ב) DAPI משמש לזיהוי תאים מתים, אשר יהיה מוכתם חיובי כאשר נרגש על 405-413 ננומטר פליטת מזוהה עם מסנן 450/40. (ג) רוחב פולס, רוחב הדופק פיזור אלקטרוניים קדימה, מגלה כפילויות, אשר צריך לחסל לפני שהם עברו סדרן תא הקרינה הופעל. (ד) gating של EGFP (ערוץ FL1) לעומת autofluorescence באמצעות יום 16 תאים קו בקרת הורים התא כגון TL1 (פאנל משמאל) מאיר הקרינה האמיתית וכך Ngn3-EGFP <sup> + אוכלוסיית תאים (פאנל מימין). (ה) החץ האדום הימני מראה ידנית משמרת של השער + EGFP ממש לפני מיון להגדיל את הפרדת תאים חיובי כוזב. בשני אירועים (ד) ו - (ה) הם מגודרת על בסיס אזורי (R1 - R3) מוצג (AC).
איור 4. Photomicrographs נציג אינסולין להביע מושבות בתרבות מוצקים למחצה. מושבות מופצים באופן אקראי להופיע קטן וחשוך, ללא אור אשכולות רעיוני. מושבות הפרט יכול להיות מאוחר יותר assayed עבור ביטוי גנים וחלבונים על ידי RT-PCR ומנתח אימונוהיסטוכימיה, בהתאמה (לא מוצג, ראו וידאו).
איור 5. Assay המושבה המאפשר הערכות תפקודית כמותי של ובתאים יחיד. ספירה של מושבות וכתוצאה מכך משמש כדי לחשב את frequency של ובתאים בין תאים מצופה מוחלט. הרכב של תאים בתוך כל מושבה מעיד על הפוטנציאל של אבי השושלת היוזם. שימוש זה assay, מצאנו כי Ngn3-EGFP + תאים שמקורם בתאי גזע עובריים Murine היו מועשר עבור אינסולין להביע המושבה להרכיב יחידות (ICFUs), ובתאים שיש להם את היכולת להתמיין אינסולין להביע המושבות 2.
טבלה 1. חצי מוצק מדיה ותרבות רכיבים סדר תוספת.
Discussion
מבחני המושבה המאפשרים הערכות כמותיות של אבות תפקודי לבלב הפרט היה מוגבל עד כה, אשר הקשו מאוד את ההתקדמות במחקרים של גזע הלבלב ביולוגיה של התא ובתאים. מהות assay מושבה היא שזה מודד את היכולת הפנימית של ובתאים, ולא רק הפנוטיפ שלהם, מה שמאפשר את הפונקציונליות ואת הפוטנציאלים השושלת של ובתאים להיות שנצפו. זהו גם כלי כמותי שניתן לקבוע את מספר אבות באוכלוסייה נתונה. בשדה גזע hematopoietic התא, מבחני המושבה מילאו תפקידים חשובים זיהוי, כמו גם לפענח את גורם הגדילה דרישות, אינטראקציות, מנגנונים המסדירים את המחויבות שושלת היוחסין של תאים אלה. 6 בתחום הביולוגיה אבי תא הלבלב, הלבלב איבר 7 , 8 או בתפזורת תרבויות 9-13 כבר המציאו, עם זאת, מבחני כזה לא כתובת questi ביולוגיתוספות ברמת תא בודד. בלי ניתוחים תא בודד, קיומו של גזע רב פוטנציאלי הלבלב / אבות לא ניתן להוכיח באופן חד משמעי. 14
כאן אנו מראים כי אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות יכול להיות assayed שימוש תלת ממדי, Matrigel המכילים, חצי מוצק מערכת התרבות. למרות תרבות השעיה מערכת 15,16 פותחה המאפשרת יחיד הלבלב מבוגר אבות להתרבות ו להתמיין "pancreatospheres", assay המושבה שלנו מספק יתרונות נוספים. ראשית, מערכת מוצקים למחצה התקשורת בתרבות שלנו מאפשר ציפוי של עד 25,000 תאים ממוינים לפי 500 התקשורת בתרבות μL לכל 24 היטב, תוך שמירה על הקמת המושבה וכתוצאה מכך בטווח ליניארי. 2 לעומת זאת, assay pancreatosphere ההשעיה מחייב שימוש יחיד בתצהיר תא שיטה של סדרן התא כדי לאפשר ניתוח תא יחיד, ולכן נפח גדול יותר של תרבות המדיה החממה בחללנדרשים. לכן, assay המושבה שלנו היא יחסית קלה וחסכונית לנהל כאשר מספר גדול של תאים שונים צריכים להיות בו זמנית בהשוואה לפעילויות אבי. שנית, התקשורת מוצקים למחצה שלנו מאפשר התפלגות אחידה של מרכיבי תאי מטריקס ו - גורמי גדילה, אשר מאפשר גם ריבוי והתמיינות להתרחש גם אותו. לעומת זאת, קשה יותר כדי לספק סביבה כזאת, במיוחד מטריקס, אל התאים בתרבית ההשעיה. מודעים אנו לכך כי בשיטה שלנו זה לא ניתן להוכיח בוודאות כי כל המושבה היא נגזרת של תא בודד, כמו שני אבות יכול להיות ממוצבת באופן אקראי ליד המושבה כל אחד אחר הטופס. עם זאת, בעיה זו ניתן להתגבר על ידי ניתוח משני באמצעות מניפולציה תא בודד. ישיר יד קטיף של תאים בודדים מיון יכול להוכיח בוודאות את מקור תא בודד של כל המושבה.
לסיכום, אינסולין להביע המושבה יוצרי הפעילות של הפרוgenitors למחצה מוצק התקשורת המתוארים לעיל מספק הזדמנויות ייחודיות עבור מחקרים מכניסטית של הלבלב אבות ברמת תא בודד. לדוגמה, בדו"ח קודם מצאנו כי תוספת של Matrigel, תערובת גולמי של חלבונים תאי מטריקס, בתרבות התקשורת נדרש ליצירת האינסולין, להביע מושבות של Ngn3-EGFP תאים + 2 מציע את תאי מטריקס היא חשוב אבות אלה. שימוש assay זה המושבה, זה עכשיו יהיה אפשרי להמשיך לנתח ולהגדיר דרישות מטריצה ספציפית לפעילות זו. בנוסף ללימוד אבות מתאי גזע עובריים בעכבר, אנחנו כרגע בודקים אם זו מערכת במבחנה assay תומך גם היווצרות של מושבות בולטות אחרות הנגזרות הלבלב והכבד של עכברים הלידה ומבוגרים, כמו גם רקמה אנושית הלבלב cadaveric חסר של איי.
Disclosures
אין לנו שום דבר לגלות.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות ד"ר קלאוס Kaestner על המתנה של קו Murine Ngn3-EGFP תא גזע עובריים, הגב 'לוסי בראון Core cytometry אנליטית לסיוע מיון התא. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי NIH מענקים R21DK069997 ו R01DK081587 הוענק HTK ו מקליפורניה המכון לרפואה הרגנרציה (CIRM) מעניקה הכשרה הוענק MW ו - LS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X DMEM/ F-12 (1:1) | Mediatech, Inc. | 15-090-CV | |
| Fetal Calf Serum | Tissue Culture Biologicals | 201 | Refer to Section 1.1 |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| 1X Dulbecco’s PBS | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | 7.5 % |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | Reduced Growth Factor |
| Methylcellulose | Sinetsu Chemical | 1,500 centipoise (high-viscosity) | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human Recombinant Activin βB | R&D Systems | 659-AB-025 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich | E7144 | |
| Human Recombinant VEGF-A | R&D Systems | 293-VE-010 | |
| 24-well plates | Costar | 3473 | Ultra-low Attachment |
| 60mm Petri Dish with Grid | Nalge Nunc international | 169558 |
References
- Ku, H. T. Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro. Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).
- Ku, H. T. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Chen, C. Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis. Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).
- Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity. Genes. 16, 1488-1497 (2002).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, 2447-2457 (2002).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Gittes, G. K., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter, W. J., Debase, H. T. Lineage-specific morphogenesis in the developing pancreas: role of mesenchymal factors. Development. 122, 439-447 (1996).
- Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J. Cell. Biol. 143, 827-836 (1998).
- Bonner-Weir, S. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7999-8004 (2000).
- Gao, R. Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture. Diabetes. 52, 2007-2015 (2003).
- Gao, R., Ustinov, J., Korsgren, O., Otonkoski, T. In vitro neogenesis of human islets reflects the plasticity of differentiated human pancreatic cells. Diabetologia. 48, 2296-2304 (2005).
- Suarez-Pinzon, W. L., Lakey, J. R., Brand, S. J., Rabinovitch, A. Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).
- Hao, E. Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas. Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Seaberg, R. M. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).
- Rovira, M. Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).
