1. Farklılaşma, pankreas-benzeri hücreler in vitro fare ES hücrelerinin koloni tahlil için klimalı ortam oluşturmak için (CM ) Fare ES hücre bakımı için prosedürler, daha fazla farklılaşması için süspansiyon kültür ve ek kültür embriyoid vücut (EB) oluşumu, daha önce 1-3 açıklanan ve bu raporun odak olmuştur. Şematik bir sunum farklılaşma protokolde yer alan adımları Şekil 1'de gösterilmiştir. Yüksek kaliteli şartlandırılmış ortam elde etmek için, ilk önce, bunların en az% 30-40, en az 150 mm çapları ile olduğu 6 gün eski EBS oluşturmak için önemlidir. Büyük EBS gelişmiş farklılaşma (Şekil 2) öne ışık mikroskobu altında koyu renkli lekeler, içermelidir. Yüksek kalitede fetal buzağı serumu (FCS) seçimi gibi EBS oluşturmak için kritik öneme sahiptir. Yüksek kalite FCS pek çok diferansiye desteklemek için yeteneklerine göre seçilirEBS iyon insülin 1, glukagon ve daha sonraki aşamalarda amilaz 2A gen ekspresyonu (18-20 gün), RT-PCR analizi ile tespit doğru. Hafifçe kuyuların merkezi haline toplamak için gün-6 EBS plakaları döndürmek için önemli Ayrıca, gün-6 EBS süspansiyon kültürünün eklenti kültür (6 kuyucuğu iyi ortalama 100 EBS yaklaşık 80) aktarılır. Sonraki eki kültür aşamasında EBS pankreas gibi hücrelerin daha iyi gelişme hücre-hücre temas sonucu geliştirmek nedenleri bilinmiyor, manevralar için. Kültür 13. günde, taze ek kültürü ile eki kültür ortamı (DMEM/F-12 (1:1),% 15 nakavt serum değiştirme, 2 mM L-glutamin, 50 U / ml penisilin, 50 mikrogram / ml streptomisin) yerine medya containing10 mM nikotinamid, 0.1 nM eksendin-4, ve 10 ng / mL insan rekombinant aktivin SSB (tüm konsantrasyonlarda kesindir). Kültür günde 16, 1.1 adım medya toplamak ve 0.2 mikron polieterler filtresindenulfone membran. Bu noktadan itibaren toplanan medya klimalı ortam (CM) olarak sevk edilecektir. Kısım 15 ml Falcon tüp içine CM ve -80 ° C 'ye kadar yarı-katı kültür hemen önce (bkz. Bölüm 3). 2. Pankreas gibi bir floresan aktif hücre sıralayıcı kullanarak tek bir hücre süspansiyonu atalarıdır Elde Etme Knock-fare ES hücre hattı, 4 EGFP muhabiri gen Ngn3 lokus bir alleli, daha önce açıklanan 2 Ngn3 bir temel içeren helix-loop-heliks (bHLH) transkripsiyon faktörü olarak farklılaşmış yerine Ngn3 EGFP, olarak belirlenmiş 5 Gün-16 kültürleri normal gelişimi sırasında pankreatik endokrin atalarıdır ifade farklılaşmış Ngn3 EGFP + ve Ngn3 EGFP elde sıralaması – hücreleri 1,2 Farklılaşmış hücreler tek bir hücre süspansiyonu çözülmesi. Inkübe gün-16 kültürleri with% 0.25 tripsin-EDTA (3 dk, 37 ° C) kültür kuyulardan hücreleri yerinden. Tripsin aktivitesi durdurmak için% 10 FCS ekleyin. , Magnezyum ve kalsiyum hücre yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS) 5 dakika boyunca 300 xg'de% 0.1 sığır serum albumini (BSA) ve santrifüj içeren. Süpernatantı ve 4 mg / ml kollajenaz B ve 2000 U / ml deoksiribonükleaz (DNaz) (30 dk, 37 ° C) ile hücre kümeleri, tek bir hücre süspansiyonu üretmek için kuluçkaya yatmaktadır. Hücre pelet ayrışma sürecini hızlandırmak için her 10 dakikada bir bozabilir 1000 mcL pipet kullanın. Hücreleri% 0.1 BSA içeren PBS ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj. Süpernatantı ve% 0.1 BSA içeren PBS ile hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Sıralama için hücrelerin hazırlanması. Sıralama sırasında hücre reaggregation önlemek için her türlü mL hücre süspansiyonu için 2 mcL DNaz I (1 MU / ml) ekleyin. 40 – 70 mikron m yoluyla Pass tek hücre süspansiyonubüyük hücreli agrega kaldırmak için ESH. Tek hücre süspansiyonu DAPI (1 mcg / mL son konsantrasyon) ekleyin. Bir hücre sıralayıcı flow sitometri veri elde. MoFlo MLS (Beckman Coulter) hücre sıralayıcı bu rapor için kullanılmıştır. Sıralama için hücre popülasyonlarının yolluk. Ngn3-EGFP + ve – Ngn3-EGFP hücreleri forward scatter karşı tarafında dağılım ile ilk kapılı (Şekil 3A), DAPI karşı tarafında dağılım (Şekil 3B), darbe genişliği vs. Tarafında dağılım (Şekil 3C) tarafından takip ve nihayet FL1 vs otomatik floresans (Şekil 3D). Sıralama sırasında hücreler Ngn3-EGFP kirlenmesini sınırlamak amacıyla; Ngn3-EGFP nihai sıralama kapısı + hücreler bilerek hakkı (ok Şekil 3E) taşınır. Negatif kontrol için yolluk Ngn3-ES EGFP çizgi ya da aynı sahnede, gün-16 kültür TL1 ES hücreleri (Şekil 3D, sol panel) gibi transgenik olmayan bir çizgi, kullanılabilir, her iki gün-6 EBS. Sıralama Ngn3 EGFP + ve Ngn3 EGFP <sup> hücreler. 3. Sıralanmış hücreleri yarı-katı kültür Kaplama Matrigel hazırlanması. Tüp başına 1 ml ve kullanmadan önce -20 ° C'de muhafaza kısım Matrigel. Donmuş halde 4 konulmalıdır ° C 3 saat kullanımdan hemen önce çözünmesi için gece boyunca ya da buz. Çözülmüş alikotları resolidification önlemek için, yarı-katı kültür hazırlanması sırasında buz üzerinde kalmalıdır. Metilselüloz solüsyonu (% 3.3) hazırlanması. Metilselüloz toz otoklava olamaz. Bakteri serbest metilselüloz çözüm elde etmek için, hazırlık sürecinde temiz ağırlığındaki tekneler ve otoklava heyecan bar, bardak, matara ve diğer donanım kullanın. Bir gün önce metilselüloz çözeltisi, steril çift distile su deposu 200 mL, 4 ° C Ayrıca, 2x 500 ml ve 100 U / ml penisilin içeren DMEM/F12 medya (toz DMEM / F-12 eriterek hazırlamak distile su iki katına) hazırlamak4 az 100 mcg / ml streptomisin ve mağaza ° C Metilselüloz hazırlık gününde, üstüne bir parça alüminyum folyo ile 1000 ml'lik cam behere 500 mL steril çift distile su ekleyin. Hava kabarcıkları su kurtulmak için en az 30 dakika kaynatın. 2000 ml'lik cam balona büyük ölçekli bir heyecan bar (uzunluğu en az 3 inç) yerleştirin. 300 ml kaynar su ölçün ve erlene aktarın. Bir heyecan plaka (ısıtma olmadan) şişesi yerleştirin. Yavaş yavaş hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için sıcak su karıştırılır. Metilselüloz tozu 33 gram ağırlığında ve çok yavaş sıcak su ekleyin. Sıcak su verimli metilselüloz tozu, ıslak ve soğuk sonraki çözülme yardım etmek için gerekli. Toz sıcaklığı yaklaşık 40-45 azalır kadar çırpmaya devam edin ° C 200 ml soğuk steril çift distile su soğutma metilselüloz karışıma ekleyin. Hemensonra, bu metilselüloz sulu fazına çözme gösteren, çözüm saydam ve viskoz açmak görmek için başlamalıdır. Çözüm sağlamak için El girdap şişeyi iyice karıştırılır. 500 ml soğuk 2x DMEM/F12 medya ekleyin. Karıştırmak için elle girdap devam edin. Soğuk bir odaya heyecan plaka şişesi koyun ve yavaş yavaş 24-48 saat metilselüloz çözüm karıştırın. Depolama şişe başına 125 ml, ve -20 ° C'de saklayın içine kısım çözüm Bir örnek steril bir petridish boşaltılan ve 37 ° C inkübatör sterilite test konulmalıdır. Çözülmüş metilselüloz çözüm 2 aya kadar buzdolabında saklanabilir. Koşullu ortam hazırlanması. Çözülme CM (bkz. Bölüm 1) hemen önce kullanın. CM yarı katı kültür hazırlama boyunca buz üzerinde tutun. Aşağıdaki büyüme faktörleri hazırlayın: 1.0 M nikotinamid, 0.1 mcM eksendin-4, 10 mcg / ml rekombinant insan aktivin βB, ve 10 & mu, g / ml VEGF-A. ° C ve aktivin βB ve VEGF-A -80 ° C -20 nikotinamid ve eksendin-4 saklayın ve kullanmadan önce bunları hemen Çözülme. Bütün yarı katı kültür ortamı bileşenleri kaplama sırasında buz üzerinde tutulmalıdır. Ayrıca VEGF-A daha sonra koloni oluşumu için gerekli olduğunu belirtmek gerekir. 2 Fetal buzağı serumu hazırlanması. FCS kullanım önce inaktive ısı olmalıdır. 30 dakika boyunca FCS inkübe 56 ° C kompleman proteinleri inaktive bir su banyosu. Ilk FCS stok şişe fazla 500 ml kısım 125 ml flakon içine tutar. Tüm hacim, yüzey alanı artırılmış ve hatta iyi bir ısıtma sağlayacaktır. -20 ° C'de saklamadan önce şişe en az 1 saat oda sıcaklığında soğumaya bırakın Çözülmüş FCS 0.2μm kullanmadan önce filtre edilir. Sıralanmış hücreler kültür bileşeninin karıştırın. Katılaşma önlemek için her zaman hazırlanması sırasında buz üzerinde hücreleri ve tüm yarı-katı ortam bileşenleri tutunMatrigel. Dahil olmak üzere Matrigel ile temas eden tüm kaynakları, pipet uçları, şırıngalar ve iğneler, soğuk olmalıdır. -20 ° C ile en az yarım saat kullanmadan önce bu malzemeleri koyun. Kişi başına 24 plaka numaralı seribaşı olması hücrelerin miktarı belirleyin. 24-de ortalama 25.000 hücrelere kaplama olabilir. Bir optimal tohumlama hücre sayısını belirlemek için ilk deneylerde hücre yoğunluğu bir titrasyon gerçekleştirebilir. Tablo 1'de açıklanan sıra bir çırpıda kapağı (hücrelerin erken uyarılması önlemek için son eklenen olduğunu unutmayın) ile 5 ml polistiren tüp kültür bileşenlerini ekleyin. Ilk polistiren tüpler için% 3.3 metilselüloz ekleyin ve sıralaması hücreleri son. % 3.3 metilselüloz çözüm hazırlanan ve 16 ½ gauge iğne ve yeterli işaretlenmiş mezun şırınga ile polistiren tüpler eklenecek ihtiyacı olduğunu unutmayın. Için doğru bir biçimde genel olarak,% 3.3 metilselüloz sol gibi, viskoz çözümleri hacmini ölçmek içinution ve nihai bir kültür karışımı, ilk şırınga bazı çözüm aspirat için önemli, ve hemen ardından havayı dışarı atmak için çözüm dışarı itmek. Çizmek için çok zor ise% 3.3 metilselüloz çözüm oda sıcaklığına kadar ısıtılmalıdır. Ancak, polistiren tüp içine ve Matrigel ek önce reçete sonra buz üzerinde soğutulur sağlar. Sıralanmış hücreleri içeren yarı-katı medya Plate. Polistiren tüplerin kapakları olduktan sonra sıkıca yerinde, güçlü ve tüpler ellerinizi iyice sallayın. Hava kabarcıkları bu işlem sırasında oluşturulur. 5 dakika boyunca buz üzerinde veya küçük hava kabarcıkları yüzeyine kadar tüpler yerleştirin. Içeriğini aspire 16 ½ veya 18 ½ iğne ile 1 ml şırınga kullanın. Şırınga hava olmadan viskoz çözüm doğru hacmi çekmek için 3.6.2 tavsiyelerine uyun. Yavaş yavaş her 24-iyi medya 500 uL dağıtmak. Kullanımdüşük ek 24 kuyucuğu sadece. Medya iyi merkezine doğrudan ekleyin. Yarı-katı medya kuyularda otomatik olarak yayıldı. Her deneysel örnek için, quadruplicated kuyu rutin istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek amacıyla kullanılır. Sadece yatay odaklı bir 24 plaka 4 içteki sütun kültür için kullanılmaktadır. Içeren hücre kültürü nemlendirme yardım etmek için, steril su ile kalan kuyuları doldurun. 37 ° C ve% 5 CO 2 hava hücreleri inkübe edin. Büyüme faktörlerinin yanı sıra Gecikmeli. Kültür başlandıktan sonra büyüme faktörleri eklemek mümkündür. Bu tür manevraları bazı büyüme faktörlerinin sağkalım etkileri gidermek için kullanılan olabilir. 26 G 3 / 8 iğne ile 1 ml şırınga ile damladı iyi ortalama 100 mcL büyüme faktörü çözümleri ve yarı-katı ortama diffüz olabilir. 4. Işık mikro altında koloni oluşumu Gözlembaşa çıkmak Hücreler tek hücre rastgele ve kuyulardan dışarı boyunca eşit olarak dağıtılmasını sağlamak için kaplama sonrası hemen dikkat edilmelidir. Hücreleri veya ortaya çıkan koloniler en kuyuların marjı dağıtılır, bu kuyuların içine yarı-katı medya dağıtım (bkz. bölüm 3.7.4) çok zorlayıcı olduğunu gösterecektir. Kültür kuyuların marjları menisküs etkisi koloni yoğunluğu nedeniyle merkezde ikamet edenlere göre daha yüksek olabilir. Koloni sayısı kantifikasyon. 3-boyutlu medya özelliği nedeniyle, koloniler farklı odak noktaları belirir. Böylece, her koloni için odak bir ayarlama, ışık mikroskobu ile gözlem sırasında gerekli olabilir. Iki kez aynı koloni kayıt önlemek için sayarken 24 altında bir ızgara takın. Bir ızgara, bir Nunc petridish (Kat. No.169558) duvar kesim tarafından elde edilebilir. Işık mikroskobu 10x objektif lens atıl olarak kullanılan olmalıdırerve ve kolonilerin sayısı. 5. Temsilcisi Sonuçlar: Önceki deneyler, 2.5 x 10 5 fare R1 ES hücrelerinin (50 ml medya toplam) ile başlayan biri yaklaşık 5000 uygun büyüklükte gün-6 EBS oluşturmak için bekliyor olabilir göstermişti . Ngn3 EGFP ES hücrelerinin daha az verimli; 6 gün 4 kat daha fazla hücre oluşturmak için benzer büyüklükte EBS istendi. 25 gün-6 EBS içerdiğinden 1.88, ortalama ± 0.67 x 10 5 hücreleri, 1 yaklaşık olarak 37.6 x 10 6 hücre, 5000 EBS elde edilebilir . Ekin kültür sırasında hücreler 2.72 ± 0.32 kat artması beklenmektedir. 1 Bu nedenle, 5000 gün-6 EBS sıralamadan önce yaklaşık 100 x 10 6 gün-16 hücreleri verecektir. Yolluk sonra, Ngn3 EGFP + hücrelerin toplam 16 gün hücre popülasyonu (Protokol Metin Bölüm 2.2.5 ve Şekil 3) yaklaşık% 10 kadar yapacak. Örnek photomicrogrfare ES hücrelerinin insülin ifade koloniler APHS Şekil 4'te gösterilmiştir. Bu koloniler belirgin bir morfoloji; koloniler küçük, karanlık ve yansıtıcı ışık değil, tek tek hücrelerin (~ 60-100 mm) ile küçük yuvarlak koloniler. Daha önceki yayın, 2 real-time RT-PCR ve tek tek elle toplanır koloniler çift immunofluorescent boyama, C-peptid ve glukagon insülin ifade saptandı. Bu sonuçlar, endokrin hücreler gibi ilkel ilk dalga benzeyen, aynı anda en az iki adacık hormon içeren hücrelerin içine ayırt etmek için tek Ngn3-EGFP + hücreler yeteneğini göstermektedir . Dağınık tek hücreler için koloni testi in vitro (Şekil 5) çoğalması ve farklılaşması başlatmak için kapasitesine sahip olanlar atalarıdır için çalışma sağlar. Böylece, bu içsel bireysel progenitör hücrelerin işlevini ölçebilirsiniz bir testtir. Capabi atalarıdırinsülin ifade koloniler olma vasıflı denir insülin ifade koloni oluşturan birim (ICFUs) (Şekil 5). MES hücre kökenli nüfus hücreleri ICFUs zenginleştirilmiş 2 Ancak, bu atalarıdır frekans hala gelişmekte olan pankreas Ngn3 işaretleri endokrin progenitör hücreler, 5 Ngn3-EGFP +, ama Ngn3 EGFP değil fikri tutarlı düşük; 16 gün kültürden izole edilen toplam Ngn3-EGFP + nüfusun yaklaşık% 0.1 -% 0.6 ICFUs 2 Ne olursa olsun, açık bir fark koloni oluşturan verimlilik, en yüksek Ngn3-EGFP + hücreler tarafından takip bekleniyor . sonra presorted hücreleri ve Ngn3 EGFP hücreler. Şekil 1 pankreas benzeri hücreler in vitro fare ES hücrelerinin farklılaşma Timeline. Klimalı ortam (CM) üretimi için, fare ES cells EBS oluşturmak için monotiyogliserol azalan dozlarda (ilk iki gün ve 6.0 x 10 -4 M 6.0 x 10 -3 M aşağıdaki dört gün süreyle) ile ilk altı gün için% 15 FCS ile süspansiyon yetiştirilmektedir. Gün-6 EBS (iyi ortalama 80-100) sonra Eke aktarılır 6-iyi% 15 nakavt serum değiştirme içeren yemekler. % 5 FCS EBS eki hızlandırmak için kültür 6-10 gün arasında olabilir. Nikotinamid, eksendin-4 ve insan rekombinant aktivin βB sonra medya kültürü gün 13 (bkz. bölüm 1.1) eklenir. Medya kültürünün gün 16 toplanan ve bu noktada klimalı ortam haline gelmiştir. Gün 16 hücreler daha sonra sıralanır ve koloni tayini için yarı-katı ortama kaplanmıştır. Şekil 2 fare embriyonik kök hücrelerinden elde edilen büyük gün-6 embriyoid organları Temsilcisi yüzey elde. İdeal günlük 6 EBS çapı en az 150 mikronaçmak mümkündür ve karanlık merkezleri (oklar). İfade erken pankreas progenitör belirteçleri (Pdx-1 ve Sox9) bu EBS (veriler gösterilmemiştir). 3 geliştirilmiş Şekil 3. MES hücre kökenli gün-16 Ngn3 EGFP ifade hücrelerin kapıları Sıralama. (A) scatter kapıları, hücre boyutu ve sırasıyla taneciklik göstergesi İleri ve yan, hücresel olmayan bir enkaz ortadan kaldırır. (B) DAPI 450/40 bir filtre ile tespit 405-413 nm ve emisyon heyecanlı pozitif boyanmış olacaktır ölü hücreleri tanımlamak için kullanılır. (C) Darbe genişliği, elektronik forward scatter darbe genişliği, çiftlerin, floresan aktif hücre sıralayıcı geçirilerek önce ortadan kaldırılması gerektiğini ortaya koymaktadır. (D) EGFP Ayırıcı (kanal FL1) karşı TL1 (sol panel) gibi bir kontrol ebeveyn hücre hattı otofloresans gün-16 hücreleri kullanarak gerçek floresans ve böylece Ngn3-EGFP aydınlatan <> + hücre popülasyonu (sağ panel) destek. (E) Kırmızı ok sadece yanlış pozitif hücrelerin mesafeyi artırmak için sıralama önce EGFP + kapı manuel sağ-shift gösterir. Olaylar her iki (D) ve (E) bölgelere göre kapılı olan (R1 – R3) (AC) gösterilir. Şekil 4 Temsilcisi fotomikrografı insülin ifade yarı katı kültür koloniler. Koloniler rastgele dağıtılan ve küçük, karanlık, ışık yansıtıcı olmayan kümeleri olarak görünür. Bireysel koloniler daha sonra, RT-PCR ve immünohistokimyasal analizler, (videoyu görmek gösterilmemiştir) tarafından, gen ve protein ekspresyonu için çalışılmalıdır. Şekil 5, tek progenitör hücrelerin fonksiyonel ve kantitatif değerlendirmelere olanak sağlayan bir koloni tahlil . Kolonilerin sayılandırma frekans hesaplamak için kullanılırtoplam kaplı hücreler arasındaki progenitör hücrelerin uency. Her bir koloni içindeki hücrelerin oluşumu başlatan progenitör soyundan potansiyelinin göstergesidir. Bu testte, fare embriyonik kök hücrelerinden elde edilen Ngn3 EGFP + hücreler insülin ifade koloni oluşturan birim (ICFUs), içine ayırt etmek yeteneğine sahip progenitör hücrelerin insülin ifade koloniler 2 için zenginleştirilmiş olduğu bulundu. (Tablo 1). Yarı-katı Kültür Medya Bileşenleri ve Toplama Düzeni.