शारीरिक आकार के प्रायोगिक हेरफेर में morphological स्केलिंग रिश्ते का अनुमान ड्रोसोफिला Published: October 1, 2011 doi: 10.3791/3162

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R. Craig Stillwell¹, Ian Dworkin², Alexander W. Shingleton², W. Anthony Frankino¹

¹Department of Biology & Biochemistry, University of Houston, ²Department of Zoology, Michigan State University

Summary

Morphological स्केलिंग संबंधों पर कब्जा और organismal आकार का वर्णन है. हम एक के लिए पूरी तरह से रूपांतरित कीड़ों में शरीर के आकार के प्राकृतिक सीमा के पार morphological स्केलिंग संबंधों को मापने की विधि प्रस्तुत करते हैं. एक सरल आहार हेरफेर का उपयोग हम विशेषता आकार के वितरण में वृद्धि कैसे सह - भिन्न आकृति और आकार के सटीक वर्णन की अनुमति.

Protocol

1. पालन ​​और आहार के हेरफेर के लिए शरीर के आकार और पंख के आकार में भिन्नता का उत्पादन

वाजिब और अवलोकन स्केलिंग अंततः विकास नियामक प्रक्रियाओं है कि अंतिम अंग और शरीर के आकार में परिवर्तन का उत्पादन पर टिका रिश्तों की अभिव्यक्ति . इन प्रक्रियाओं डी. जैसे पूरी तरह से रूपांतरित (यानी, holometabolous) कीड़े पर सबसे अच्छा काम से वर्णित कर रहे हैं मेलानोगास्टर, जहां अंगों ^11,15-17 लार्वा तरह कोड़ना के भीतर के रूप में undifferentiated 'imaginal डिस्क' बढ़ती . ड्रोसोफिला में, अंतिम अंग और शरीर के आकार लार्वा चरणों के दौरान विकास द्वारा विनियमित रहे हैं, पहली और दूसरी लार्वा instar के माध्यम से लार्वा बढ़ने जब ​​तक वे ^{तीसरे} लार्वा instar 18 की शुरुआत की दिशा में eclosion के लिए _{एक न्यूनतम} व्यवहार्य वजन (MVW ई) तक पहुँचने. MVW _ई की प्राप्ति से पहले भुखमरी वयस्क eclosion रोकता है. हालांकि, लार्वा कि MVW _ई में भूखे हैं व्यवहार्य वयस्कों के एक बहुत छोटे आकार में यद्यपि उत्पन्न . इस वजह से विकास के दौरान कम है पोषण न सिर्फ मक्खियों, लेकिन ^लगभग सभी 19-21 पशुओं में अंतिम शरीर और अंग का आकार कम कर देता है. MVW _ई भोजन की उपलब्धता के बाद जोड़ तोड़ करके प्राप्त कर ली है, लेकिन पहले प्यूपीकरण होता है, यह संभव है शरीर के आकार में चरम प्ररूपी plasticity है कि बहुत भिन्नता के अन्य स्रोतों (उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत आनुवंशिक परिवर्तन) outweighs प्रेरित.

1. अंडे phenotyped हो आबादी से एकत्र कर रहे हैं, 50 की बहुत सारी में विभाजित और मानक मक्खी भोजन के 10ml युक्त शीशियों में रखा. क्योंकि oviposition लगातार होती है, अंडे तीन दिनों के लिए हर 24 घंटों एकत्र कर रहे हैं तीन साल की उम्र साथियों का निर्माण किया.
2. जब सबसे पुराना काउहोट भटक स्तर तक पहुँच या कोषस्थ कीट धारण करना शुरू कर दिया है, आहार हेरफेर लागू किया जाता है. इस बिंदु पर, सबसे पुराना काउहोट MVW _ई अच्छी तरह से परे है, सबसे कम उम्र काउहोट बहुत MVW _ई करीब है और शेष काउहोट में इन चरम सीमाओं के बीच कहीं है. इस प्रकार, भोजन के इस बिंदु पर हटाने का सबसे पुराना काउहोट से बहुत बड़ी वयस्कों का उत्पादन, सबसे कम उम्र के और शेष काउहोट से काउहोट मध्यवर्ती आकार के वयस्कों से बहुत छोटे वयस्कों. सभी शीशियों को शीशियों से लार्वा, लगभग 40% sucrose के समाधान के 5ml निकालने के लिए जोड़ा जाता है. लार्वा को मुक्त करने के लिए, भोजन के एक मध्यवर्ती गति के लिए सेट एक प्रकार के बरतन मेज पर 15-20 मिनट के लिए उत्तेजित है.
3. फ्लोटिंग लार्वा एक ठीक तूलिका (00) के साथ sucrose के समाधान, एक गीला कपास प्लग युक्त शीशियों में रखा और कोषस्थ कीट धारण करना करने की अनुमति दी से हटा रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, लार्वा एक गैर सुपाच्य मिथाइल ²² सेलूलोज़ जैसे खाद्य additive पर रखा जा सकता है है .

2. शरीर के आकार का आकलन

वाजिब और अवलोकन. पिछले अध्ययनों से संकेत मिलता है कि छाती लंबाई एक ^{संपूर्ण} शरीर आकार 22 के लिए आदर्श प्रॉक्सी से कम है. इसके बजाय, हम शरीर के आकार का एक उपाय के रूप में पोटा संबंधी आकार का उपयोग करें. अधिकतम शरीर के आकार कि प्यूपीकरण पछाड़ खिलाने की समाप्ति पर तय हो गई है. एक परिणाम के रूप में, वहाँ पोटा संबंधी आकार और वयस्क शरीर आकार ²³ के बीच एक तंग सहसंबंध है .

1. Pupae ventral पक्ष की व्यवस्था कर रहे हैं गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर और एक विदारक माइक्रोस्कोप से जुड़ी एक डिजिटल कैमरे का उपयोग कर imaged. प्रत्येक छवि पर कब्जा कर लिया है, एक अद्वितीय पहचान कोड को सौंपा और एक जीवित फ़ीड कंप्यूटर के लिए डिजिटल कैमरे को जोड़ने के माध्यम से एक कंप्यूटर पर स्थानांतरित.
2. Imaged pupae व्यक्ति 2 मिलीलीटर मक्खी भोजन की 1ml युक्त epitubes, उस व्यक्ति के लिए अद्वितीय कोड के साथ लेबल के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं, और airholes साथ पंचर गैस आदान - प्रदान की अनुमति है.
3. पोटा संबंधी पोटा संबंधी सिल्हूट के पिक्सल की संख्या के रूप में आकार का अनुमान है. अन्य आकार मैट्रिक्स भी इस्तेमाल किया जा सकता है.

3. विशेषता (विंग) आकार आकलन

वाजिब और अवलोकन. छवि पंख करने के लिए, हम विंग धरनेवाला ^24, जो खींचती है और एक जीवित, anesthetized मक्खी अपने शरीर को सीधा के पंखों रखती का उपयोग करें. कांच के दो टुकड़े के बीच दबाया, इस विंग एक दो आयामी वस्तु के रूप में imaged करने की अनुमति देता है.

1. मक्खियों anesthetized हल्के और सीओ ₂ के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप एक डिजिटल कैमरा है कि एक कंप्यूटर से जुड़ा है के साथ फिट पर पंख धरनेवाला में स्थिति में रखा.
2. विंग imaged है और उस व्यक्ति के लिए अद्वितीय कोड के तहत बचाया है.
3. विंग आकार न्यूनतम उत्तल बहुभुज है कि सीमांत तय स्थलों विंग सिल्हूट के पिक्सेल गिनती के रूप में या circumscribes का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है.

4. स्केलिंग संबंध अनुमान

1. डेटा साथियों भर pooled हैं, लेकिन सेक्स से अलग और लॉग तब्दील.
2. स्केलिंग संबंधों को आकार प्रकार द्वितीय (यानी, कम मेजर ऐक्सिस) प्रतिगमन ⁽¹² समीक्षा में देखें) और प्रत्येक समूह के लिए अनुमान मापदंडों का उपयोग कर डेटा के लिए फिट हैं.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

तम्बू "> हमारे आहार हेरफेर शरीर (चित्रा 1) आकार और विशेषता आकार (चित्रा 2) के एक विस्तृत रेंज का उत्पादन लॉग तब्दील लक्षण एक दूसरे के खिलाफ साजिश रचने एक दिया समूह के भीतर जैविक covariation के अपने पैटर्न से पता चलता है और स्केलिंग संबंध फिटिंग परमिट. समूह (चित्रा 3) स्केलिंग संबंध मापदंडों का निष्कर्षण का वर्णन है कि कैसे शरीर के आकार के साथ आकार तराजू समूहों में आकार के साथ आकार कैसे covaries की तुलना की अनुमति देता है.

चित्रा 1. कोषस्थ कीट के बाद आकार आहार हेरफेर के माध्यम से उत्पादन वितरण के चरम _से व्यक्तियों MVW ई प्राप्त करने के. वास्तविक पोटा संबंधी छवियाँ सही में पोटा संबंधी आकार के माप के लिए उनके इसी silhouettes के साथ छोड़ दिया पर दिखाए जाते हैं. स्केल बार 1mm है.

चित्रा 2 पंख शरीर के आकार आहार हेरफेर के माध्यम से उत्पादन वितरण के चरम से लिया बाद व्यक्तियों MVW _ई प्राप्त. वास्तविक छवियों विंग विंग दाईं तरफ दिखाया आकार की माप के लिए उनके इसी silhouettes के साथ छोड़ दिया पर दिखाए जाते हैं. स्केल बार 1mm है.

चित्रा 3. विंग शरीर ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लिए सेक्स से आकार स्केलिंग . प्रत्येक लिंग के व्यक्तियों है कि (काले घेरे) पूरी तरह से खिलाया, लार्वा के रूप में एक (ग्रे हलकों) या दो दिन (खुला हलकों) भूखे थे के लिए लॉग ऑन करें - बदल डेटा. प्रकार द्वितीय प्रतिगमन लाइन प्रत्येक सेक्स के लिए दिखाया गया है. प्रत्येक उम्र काउहोट के बीच में, औसत विंग के क्षेत्र में गिरावट ~ 0.1mm ~ (7%) और ~ 0.2mm (~ 8%) होता है, मनाया phenotypes की कुल सीमा में वृद्धि. regressions से पता चलता है कि महिलाओं में इस स्केलिंग संबंध (0.96 की ढलान) के लिए थोड़ा hypoallometric हैं जबकि पुरुषों थोड़ा hyperallometric रहे हैं (1.06 ढलान).

Discussion

Morphological स्केलिंग लगभग एक सदी के लिए विकासवादी जीव विज्ञान में गहन अध्ययन का विषय रहा है. हाल ही में, विकास और स्केलिंग के विनियमन के आसन्न आधार विकास, शरीर विज्ञान, और आनुवंशिकी (उदाहरण के ^लिए, 12,15,23-25 ​​में समीक्षाएँ देखें) में तेजी से महत्वपूर्ण बन गया है . हमारी पद्धति विशेषता है और शरीर के आकार की संपूर्ण रेंज भर में रूपात्मक स्केलिंग संबंधों के आकलन परमिट. यह महत्वपूर्ण हो सकता है, विशेषता आकार के रूप में शरीर के आकार ^{(जैसे,} 13,14) के साथ रैखिक पैमाने पर नहीं कर सकते कर सकते हैं. हालांकि, यह स्पष्ट नहीं हो अगर पशुओं आदर्श शर्तों के तहत प्रयोगशाला ही पाला जाता है हो सकता है.

हालांकि हमारे प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से विकसित किया गया था ड्रोसोफिला में पंख शरीर आकार स्केलिंग संबंध का आकलन की अनुमति, यह विशेषता विशिष्ट संशोधन के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है मक्खियों में किसी भी morphological विशेषता के लिए स्केलिंग संबंधों का अनुमान है. इसी तरह, आहार हेरफेर की संभावना अन्य पूरी तरह से रूपांतरित कीड़ों में विशेषता और शरीर के आकार की पूरी रेंज का उत्पादन किया जा सकता है, ऐसे आवेदनों बस जानने की _{आवश्यकता} है जब MVW ई हासिल की है और उस बिंदु पर व्यक्तिवृत्त में हेरफेर आवेदन.

Materials

None.