Summary
وأظهر lensless على الرقاقة منصة المجهر الفلورسنت التي يمكن أن الكائنات صورة الفلورسنت عبر واسعة جدا مجال الرؤية من لمثل> 0،6-8 CM2 مع القرار 4μm <باستخدام عينة الضغط على فك الخوارزمية. يمكن لهذا الاتفاق على نطاق واسع في الميدان الفلورسنت طريقة التصوير على رقاقة لتكون ذات قيمة عالية الإنتاجية الخلوي ، والبحوث نادرة خلية التحليل وميكروأري.
Abstract
على رقاقة التصوير lensless بصفة عامة تهدف إلى استبدال عدسة الضخمة القائمة على المجاهر الضوئية المدمجة مع تصاميم أكثر بساطة وأكثر من ذلك ، وخاصة بالنسبة للتطبيقات الفرز الفائق الإنتاجية. هذه التكنولوجيا الناشئة منصة لديه القدرة على القضاء على الحاجة إلى المكونات البصرية الضخمة و / أو مكلفا من خلال مساعدة من نظريات الرواية والخوارزميات إعادة الإعمار الرقمية. وعلى نفس المنوال ، ونحن هنا في إثبات وجود رقاقة طريقة المجهر الفلورسنت التي يمكن أن تحقق مثل <4μm القرار المكانية عبر واسعة جدا مجال الرؤية من (FOV) من> 0،6-8 سم 2 من دون استخدام أي عدسات والميكانيكية المسح أو الأغشية الرقيقة المرشحات تدخل القائمة. في هذه التقنية ، ويتم تحقيق الإثارة الفلورسنت من خلال واجهة زجاجية كروية أو المنشور مضيئة من مصدر غير متماسكة. بعد التفاعل مع حجم الكائن بأكمله ، يتم رفض هذا الضوء الإثارة بواسطة الانعكاس الكلي الداخلي ، (TIR) العملية التي تحدث في الجزء السفلي من الشريحة الصغيرة fluidic العينة. ثم يتم جمع انبعاث الفلورسنت من الكائنات متحمس بواسطة غطاء من الألياف البصرية أو تفتق ألف ويتم تسليمها إلى مجموعة أجهزة الاستشعار البصرية الالكترونية مثل المسؤول عن جهاز جانب (CCD). باستخدام الضغط أخذ العينات خوارزمية فك القائمة ، يمكن أن تكون lensfree الخام الحصول على الصور من العينة الفلورسنت معالجتها بسرعة لانتاج مثل <4μm القرار عبر FOV من> 0،6-8 سم 2. علاوة على ذلك ، مكدسة رأسيا الدقيقة القنوات التي تكون مفصولة على سبيل المثال ، يمكن أيضا 5-10 ميكرون يمكن تصوير بنجاح باستخدام lensfree نفسه على منصة رقاقة المجهر ، مما يزيد من الإنتاجية الإجمالية لهذه الطريقة. هذا الاتفاق على الشريحة منصة التصوير الفلورسنت ، مع فك الضغط a السريع وراء ذلك ، يمكن أن تكون ذات قيمة بدلا عن الإنتاجية العالية الخلوي ، والبحوث نادرة خلية التحليل وميكروأري.
Protocol
في هذا القسم ، وسوف نستعرض الطرق التجريبية لدينا lensless على الرقاقة منصة المجهر الفلورسنت 1-4. للبرهنة على قدرات هذه التقنية ، فإننا سوف تظهر نتائج التصوير على الرقاقة للجسيمات الدقيقة الفلورسنت والمسمى خلايا الدم البيضاء. على الرغم من عدم مناقشتها هنا ، يمكن أيضا لنفس lensfree منصة المجهر الفلورسنت يمكن استخدامها لصورة النموذج الحيوانات الصغيرة مثل جيم المعدلة وراثيا عينات ايليجانس 3.
1. تصميم منهاج Lensless التصوير على الرقاقة
لدينا lensless منصة التصوير على رقاقة تضم العديد من المكونات البصرية بما في ذلك مجموعة أجهزة الاستشعار الرقمية (مثلا ، شريحة CCD) ، وهو مصدر الإضاءة غير متماسكة ، المنشور أ ، عامل تصفية الامتصاص ، وهو غطاء من الألياف البصرية أو تفتق الألياف البصرية. كما هو مبين في Fig.1 ، ويتم تجميع هذه المكونات مع الصغير fluidic أجهزة التصوير لتحقيق الفلورسنت من حجم العينة على شريحة كبيرة ، من دون استخدام أي عدسات ، والماسحات الضوئية ميكانيكية أو الأغشية الرقيقة المرشحات تدخل القائمة.
- مجموعة أجهزة الاستشعار الرقمية : مواصفات لدينا التصوير lensless تستخدم مجموعة أجهزة الاستشعار البصرية الالكترونية لتسجيل هدف من الانبعاثات الفلورسنت الكائنات الدقيقة. في هذا النظام الأساسي ، للكشف عن إشارة مضان ، يمكن استخدام أنواع مختلفة من أجهزة الاستشعار صفائف ، مثل أجهزة المتقارنة بواسطة الشحنات (على سبيل المثال ، نماذج : KAF - 8300 ، كاي 11002 ، 39000 ، KAF ، وجميعهم من KODAK) وتكميلية المعادن أكسيد أشباه الموصلات ، التصوير (CMOS ، على سبيل المثال ، الموديل : MT9T031C12STCD ، من تقنيات ميكرون). المعايير الأساسية التي تهم هذه المصفوفات مستشعر تشمل حجم بكسل (على سبيل المثال ، 5،4 ميكرون ، 9 ميكرون ، و 6.8 ميكرومتر و3.2 ميكرومتر KAF - 8300 ، كاي 11002 ، 39000 وKAF - MT9T031C12STCD ، على التوالي) ومنطقة التصوير النشط ( على سبيل المثال ، 2.4 سم 2 ، 8 سم 2 ، 18 سم 2 و 32 مم 2 للKAF - 8300 ، كاي 11002 ، 39000 وKAF - MT9T031C12STCD ، على التوالي). لlensfree على رقاقة التصوير ، ويمكن استشعار CCD عموما يفضل لتحقيق أعلى إنتاجية (منطقة أوسع النشط) ، وتحسين حساسية ، بينما يمكن استشعار CMOS المفضل لتصاميم الوزن أرخص وأخف وزنا نسبيا (على سبيل المثال ، للاستخدام الميداني).
- يمكن استخدامها في برنامجنا ، وهو مصدر ضوء غير متماسكة ، على سبيل المثال ، بسيطة التي ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي (LED ، على سبيل المثال ، من Thorlabs ، C2 M455L2 وLEDD1B) ، لإثارة مضان : مصادر الضوء. في التجريبية انشاء هو مبين في الشكل. ومن ثم القى 1 ، متعدد وضع كابلات الألياف البصرية (Thorlabs ، BFH37 - 1000) مع 1 ملم حجم الأساسية هي بعقب بالإضافة إلى مصدر LED (من دون استخدام أي عدسات أو اقتران البصريات) وعلى ضوء الإثارة إلى حجم العينة من خلال فتحة خروج من هذه الألياف. في هذا النظام ، يجب أن المستوى المطلوب من السلطة أن تكون الإثارة مضان حول ميغاواط 0،2-5 ~ لFOV سم 2-8> 2 في الخروج من الألياف الإضاءة ، إلا أن المصابيح وينبغي أن تكون قادرة على انتاج ~ 5mW - 1W مستويات من الطاقة مع اقتراب بعقب اقتران ضياع كبير مما يقلل من قوة الإثارة في انتاج الألياف. لتحقيق الإثارة من الأصباغ المختلفة ، ويمكن أيضا أن تكون المصابيح لون مختلف المضاعفة باستخدام مقرنة الألياف البصرية.
بالإضافة إلى رقاقة التصوير على الفلورسنت ، ويمكن أيضا نقل الصور الثلاثية الأبعاد lensfree لنفس العينة يمكن الحصول عليها مع هذا المنبر من خلال الاستفادة من مصدر الإضاءة العمودية كما هو موضح في الشكل. 2. خلافا للألياف الإثارة مضان ، لالتقاط صور ثلاثية الأبعاد ، وهي مختلفة من الألياف البصرية مع حجم أصغر الأساسية (على سبيل المثال ، ~ 5-40 ميكرون) هو بعقب بالإضافة إلى مصدر آخر LED (Mightex ، FCS - 0625-000). هذا الضوء الإضاءة العمودية ، وبعد الخروج من الألياف نهاية ، ويبدأ في اكتساب الانسجام المكاني جزئية لأنها تنتشر في اتجاه العينة. القطر من هذه المنطقة متماسكة مكانيا يتناسب مع المسافة التي يقطعها الضوء في ويتناسب عكسيا مع حجم فتحة خروج من الألياف. ما دام هذا القطر التماسك المكانية في الطائرة عينة أكبر من حجم الحيود من كل عينة على الطائرة الاستشعار ، يمكن للضوء متناثرة من كل كائن يتدخل بأمانة مع ضوء الخلفية ، وخلق lensfree في خط الهولوغرام من العينة. يمكن لهذه الصور المجسمة المكتسبة lensfree عندئذ معالجتها بسرعة باستخدام نهج تكراري مرحلة الانتعاش لإعادة الإرسال مشرق الميدان صورة من حجم العينة 5-7. لهذه الغاية إنارة الثلاثية الأبعاد ، ويعد الطول الموجي الصمام (أي ، ~ 625-700 نانومتر) محددا منذ مرشحات امتصاص التي يتم استخدامها لحجب ضوء الإثارة وعالية تمرير المرشحات مع موجات قطع نموذجية على سبيل المثال ، 500 ل 600Nm ، الذي يسمح لانتقال العدوى في اقتناء خط الهولوغرام من العينات من دون قضية. - المكونات البصرية الأخرى : في هذا النظام الأساسي على رقاقة المجهر الفلورسنت ، ويتم استخدام طريقتين مختلفة الإثارة تصفية بالتوازي المطلوبة لإنشاء خلفية داكنة الحقل كما هو مبين في Fig.2. أولا ، المنشور الزجاجي (على سبيل المثال ، ادمونديتم استخدام البصريات ، والمعينية أو مواشير حمامة) أو الزجاج نصفي المجال لإنشاء مجموع - انعكاس الداخلية (على ضوء الإثارة) على السطح السفلي من الشريحة الصغيرة التي تستضيف fluidic عينات من الفائدة. في موازاة ذلك ، يتم استخدام عامل تصفية امتصاص رخيصة (على سبيل المثال ، من Roscolux) إزالة ضوء الإثارة متناثرة ضعيفة لا طاعة لعملية النقل البري الدولي. عند رفض الناجح لإثارة باستخدام هاتين الآليتين ، ويكتسب فقط من انبعاث الفلورسنت من العينات على الطائرة كاشف. نلاحظ هنا أن نسبة معينة من الإشارة أيضا الفلورسنت المنبعثة الخبرات النقل البري الدولي في واجهة واحدة. ومع ذلك ، فإن هذه الحدود فقط الفتحة العددية للكشف عن هذا lensfree على الرقاقة لنهج التصوير ~ 1.0 ، بحيث تظل حبيسة فقط الأشعة مائلة فوق هذه الفتحة كشف عالية العددية داخل الرقائق الدقيقة بينما بقية أشعة الفلورسنت لا يزال ضربت المنطقة النشطة من جانب مجموعة أجهزة الاستشعار لأخذ عينات من قبل خلية لها.
على الرغم من هذه الفتحة الكبيرة الكشف العددي ، والبقع الخام الفلورسنت في مجموعة أجهزة الاستشعار تصبح واسعة نسبيا (على سبيل المثال ، ~ 150-200 ميكرون) منذ الفلورسنت الانبعاثات هو الاتجاه ، وبالتالي لا يحيد بسرعة. لمهندس وتحسين السيطرة على انتشار هذه المكانية إشارة الفلورية في برنامجنا lensless ، استخدمت لدينا مكون مستو البصرية ، أي غطاء من الألياف البصرية (على سبيل المثال ، ادموند البصريات ، NT55 - 142) ، التي يتم وضعها بين الكائن و استشعار الطائرات. يتكون غطاء من الألياف البصرية لمجموعة 2D من كابلات الألياف البصرية التي تحمل كثافة المعلومات البصرية من جانب واحد من جهاز إلى آخر. وظيفتها الرئيسية في lensfree لدينا على رقاقة المجهر هو انشاء لزوجين وسائط الفضاء الحر من الانبعاثات الفلورسنت من حجم العينة في الموجات الضوئية الموجهة السفر دون انتشار المكاني داخل كل من الألياف ، والتي يمكن تضييق جزئيا بانخفاض نقطة lensfree الفلورسنت الانتشار وظيفة (PSF) بين الكائن والطائرات كاشف. هذه الزيادات لدينا مزيد من الإشارات إلى نسبة الضوضاء (SNR) وكذلك القرار المكانية التي يمكن تحقيقها باستخدام برنامجنا lensless.
كبديل لوحة الواجهة العادية ، ويمكننا أيضا الاستفادة من برنامجنا في التصوير على رقاقة "مدبب" الألياف الضوئية غطاء التي لديها كثافة أكبر بكثير من كابلات الألياف البصرية على وجه لها أعلى مقارنة مع واحد القاع. هذا غطاء مدبب لا يساعد فقط لنا تحقيق أفضل PSF ، ولكن أيضا يمكن أن يعرض التكبير في برنامجنا (على سبيل المثال ،> 2 - 3X) والتي تساعدنا على مواصلة تحسين قرارنا lensless وصولا الى مثل ميكرومتر 4 <. ينبغي أن نلاحظ أيضا أن الحقل من رأي لتصميم مثل هذه مدبب هو تخفيض مربع على الأقل عامل التكبير قدم بالمقارنة مع نظام التصوير على غطاء العادية ، والتي يمكن أن تشكل الحد من سبيل المثال ، من ~ 8 سم 2 FOV البداية (CCD : 11002 كاي) وصولا الى سم 2 <2 مع تفتق.
أخيرا ، ينبغي أن نلاحظ أيضا أن استخدام غطاء الألياف البصرية أو تفتق a يشوه الصور المجسمة lensfree من العينة بسبب أوضاع البصرية المختلفة للمصفوفة من الألياف البصرية 3. في حين أن مثل هذه الأنماط lensfree مشوهة في مجموعة كاشف يمكن أن تكون مفيدة لبعض التطبيقات المتعلقة الخلوي ، لإعادة الإعمار من الصور الثلاثية الأبعاد انتقال ، ومجموعة من الألياف البصرية (على سبيل المثال ، أو غطاء لتفتق) يحتاج إلى إزالته من التجمع على الرقاقة على حساب من القرار المكانية انخفاض طفيف في النمط 3 الفلورسنت. - fluidic رقائق متناهية الصغر : هي ملفقة ورقائق متناهية الصغر fluidic التي يتم استخدامها في برنامجنا باستخدام PDMS (Polydimethylsiloxane) وضعت على الجدران الشرائح الزجاجية خلق قنوات متناهية الصغر أن هناك حاجة لعلى رقاقة التصوير. الى افتعال هذه القنوات الدقيقة fluidic نسعى الوصفة التالية :
- تختلط موحد PDMS ألف وباء واللدائن أثار مع نسبة حجم 1:10.
- حالما يتم سكب هذا الحل غير المتجانسة لطبق بيتري ، وعلاجه عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- باستخدام سكين X - acto ، يتم استخراج الحجم المطلوب وشكل جدار القناة الصغيرة fluidic من طبق بيتري.
- ويتحقق الترابط ثم الجهاز باستخدام الترددات العالية مولد البلازما (الكهربائية ومنتجات شركة تكنيك ، BD - 10AS) ، والتي تحتاج لفضح كل من الزجاج تغطي الشرائح وPDMS منطقة الترابط.
- بعد هذا العلاج البلازما ، ويتم وضع الجهاز داخل الفرن لمدة 40-50 دقيقة في ~ 70 درجة مئوية لتعزيز الترابط.
- التجميع والمحاذاة من منصة lensless المجهري على الرقاقة :
يمكن أن يكون مفصلا للإجراءات التجميع لدينا lensfree منصة التصوير على الرقاقة على النحو التالي :- الغطاء الزجاجي للمجموعة أجهزة الاستشعار البصريات الالكترونية وإزالتها.
- باستخدام قلم فراغ (ادموند البصريات ، NT57 - 636) ، يوضع بلطف مرشح امتصاص رقيقة على الجزء العلوي من منطقة الكشف النشط.
- ويتم وضع غطاء من الألياف البصرية أو تفتق A على رأس هذا و امتصاصإلتر.
- ومن ثم ملفقة fluidic رقاقة صغيرة توضع مباشرة على الجزء العلوي من مجموعة من الألياف الضوئية.
- يتم تجميع منشور زجاجي أو نصفي الكرة أعلاه الشريحة الصغيرة fluidic باستخدام النفط مؤشر مطابقة (Cargille ، الغمر النفط السلسلة 300) بحيث يتم مطابقة معامل الانكسار واجهة زجاجية للمعامل الانكسار.
- يتم نقل الجانب الألياف الإضاءة أقرب إلى المنشور (أو نصفي الكرة) ويتم ضبط الزاوية لضمان الانعكاس الداخلي الكامل الذي يحدث في واجهة زجاجية في الهواء الموافق الركيزة أسفل الشريحة الدقيقة لfluidic. يتم محاذاة الإضاءة العمودية (للتصوير انتقال lensfree) ليكون عمودي على الصفيف كاشف وتتركز على مجال الرؤية المطلوب واحد.
- يتم تشغيل بالتسلسل الجانبية والعمودية الخفيفة مصادر / إيقاف التصوير على حد سواء لتحقيق الفلورسنت ومشرق مجال التصوير انتقال به نفسه على منصة رقاقة.
- ثم يتم الحصول على الصور Lensfree الخام باستخدام واجهة مخصصة LABVIEW المتقدمة من خلال جهاز كمبيوتر (على سبيل المثال ، 3.2 غيغاهرتز معالج إنتل كور).
2. تحضير العينة
استخدمنا حبات الفلورية الصغيرة (على سبيل المثال ، Invitrogen ، Fluospheres) لمعايرة منصة التصوير ، وذلك عن طريق قياس نظامها lensfree نقطة الانتشار وظيفة (PSF). بعد ذلك يتم قياس PSF الأولية ، ويمكن تصوير الخلايا المختلفة أو الحيوانات نموذج صغير (على سبيل المثال ، المعدلة وراثيا جيم ايليجانس عينات) باستخدام نفس منصة على الرقاقة.
بدءا من القسم الفرعي المقبل ، وسوف نقدم المزيد من التفاصيل خطواتنا إعداد العينة.
- فلوري الخرز الصغير :
- يتم الجمع بين حلول حبة الفلورية الخام بالماء DI لتحسين تركيز العينات.
- يتم خلط ~ 10 ميكرولتر من الفلورسنت حل مع 40 حبة ميكرولتر ، 5 مل و 20 مل من الماء لمدة 10 ميكرومتر DI ، 4 ميكرون وقطرها 2 ميكرون الخرز ، على التوالي. وتعد حلول غير متجانسة من الخرز المختلفة (على سبيل المثال ، غير الفلورسنت والمصابيح الفلورية) حسب الحاجة عن طريق خلط حبة حلول مختلفة مع بعضها البعض.
- ثم يتم حقن محلول العينة النهائية في رقاقة صغيرة من الجدران fluidic PDMS الجانب باستخدام إبرة حقنة حادة (فيشر العلمية وإبر PrecisionGlide دينار بحريني ، سلسلة 14-826)
- وسم الدم البيضاء الخلية :
- يتم خلط وحجم الدم كله ~ 100 ميكرولتر مع مل 1 ~ من خلايا الدم الحمراء العازلة lysing (eBioscience).
- بعد حضانة دقيقة 3 ~ ، يتم طرد الحل lysed الدم ومعلق في طبقة بيليه ميكرولتر 200 ~ من برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة).
- لتسمية الحمض النووي للخلايا مع الأصباغ مضان ، يتم إضافة 5 ميكرولتر من SYTO 1MM 16 إلى 200 من ميكرولتر إعادة تعليق ، وبعد ذلك يتم تحضين العينة عن 30 دقيقة في الظلام ~ في درجة حرارة الغرفة.
- يتم تطبيق الطرد المركزي الثاني لهذا النموذج المسمى ، حيث تتم إزالة طاف للتقليل من الضوضاء في الخلفية بسبب الانبعاثات من الأصباغ الفلورية غير منضم.
- هو معلق خلايا الدم البيضاء بيليه في برنامج تلفزيوني الطبقة التي يمكن بعد ذلك نقلها إلى رقاقة صغيرة fluidic لlensfree على رقاقة التصوير فلوري (انظر على سبيل المثال ، الشكل 7).
3. المعالجة الرقمية للصور المكتسبة الفلورسنت lensless
في هذا المنبر التصوير lensless ، يتم استخدام اثنين خوارزميات مختلفة لزيادة رقميا القرار للنظام ، وهما لوسي deconvolution ريتشاردسون ، وأخذ العينات الضاغطة على فك الترميز. من خلال استخدام هذه الأساليب المعالجة الرقمية ، ونحن كميا تعزيز القرار الذي يمكن أن يتحقق مع كل نهج طريق حل معبأة بشكل وثيق حبة أزواج (انظر الشكلين 5-6). يمكن ثم أعيد بناؤها الصور الفلورسنت lensfree يكون pseudocolored (الرغبة) لتسليط الضوء على اللون الطبيعي من الكائنات الدقيقة ، التي تتطلب بالتأكيد معرفة مسبقة من الطول الموجي إشارة نيون ، إلا إذا كان اللون (على سبيل المثال ، وهو RGB : الأحمر والأخضر والأزرق CCD / يستخدم CMOS) رقاقة الاستشعار. عن هذه الأساليب المعالجة الرقمية ، تستخدم خوارزميات متطورة مخصصة التي لا تتطلب سوى وحدة المعالجة المركزية (على سبيل المثال ، وهو المعالج 3.2 غيغاهرتز ، إنتل كور). يحتمل ، يمكن أيضا الجيل الجديد من وحدات معالجة الرسومات (جرافيكس) تستعمل لمعالجة أسرع. بالإضافة إلى التصوير ، وإذا لزم الأمر ، يمكن أيضا للكائنات فك الفلورسنت تحسب تلقائيا باستخدام واجهة مخصصة نموا (انظر الشكل رقم 8) للتطبيقات الخلوي على الرقاقة.
- قياس نقطة نظام الانتشار الفعل (PSF) :
قبل أية معالجة رقمية لتحسين الدقة (مثل فك الضغط أو deconvolution) ، وغير متماسكة نقطة الانتشار ظيفة من وظائف النظام على رقاقة يحتاج إلى أن يكون تقديريا ، وهو ما يمكن تحقيقه عن طريق حساب متوسط قياس lensfree عدة أنماط الفلورسنت التي أنشأتها صغيرة معزولة الفلورسنت الخرز تقع على ارتفاع معين من رقاقة الاستشعار. هؤلاءثم يتم محاذاة أنماط الفلورسنت الفردية فيما يتعلق مركزها الإحداثيات الشامل بعد أن بلغ متوسط كثافة مناسبة 1،2 التطبيع. ويمكن هذا النمط lensfree متوسط ثم استخدمت بوصفها وظيفة نقطة الانتشار الفلورسنت مجهر على الرقاقة لدينا. - لوسي - ريتشاردسون Deconvolution 1 : تحسين رقميا القرار المكاني لبرنامجنا ، ونحن تغذية الخام صورة الفلورسنت المكتسبة وغير متماسكة وظيفة نقطة قياس الانتشار المتسارع الى 80-10 الخوارزمية لوسي - ريتشاردسون. من خلال تطبيق نظرية وبايز ، الخوارزمية ، لوسي ريتشاردسون يستخدم قياس نقطة الانتشار وظيفة لتحسين تكرارا تقدير احتمال الأقصى للتوزيع المصدر مضان على الطائرة 8،9 الكائن. يتم إنهاء عملية التكرار عادة بعد بضع مئات من الدورات قبل ظهور التضخيم الضوضاء لضمان الحد الأدنى من خطأ مربعا بين المتوقع وقياس أنماط lensfree الفلورسنت. كما تم تسريع التقارب بين هذه الخوارزمية deconvolution بواسطة ناقل طريقة الاستقراء لتقصير الوقت اللازم للحساب 10. لاعطاء فكرة : هذه الخوارزمية يوفر الحل الفعال المكاني للميكرومتر 20 ~ (باستخدام رقاقة CCD / CMOS بحجم بكسل على سبيل المثال ، ~ 9μm) ويمكن deconvolve an FOV سم 8 ~ 2 في غضون بضع عشرات من الدقائق على جهاز كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل العادية مطلب 1. علما بأن الوقت نفسه ينخفض إلى حساب ثوان معدودة ، مثلا ، ~ 1MM 2 FOV وهو مشابه لFOV من عدسة الهدف 10X نموذجي.
- الضغط أخذ العينات / الاستشعار عن بعد مقرها متفرق اشارة فك 2 : زيادة تحسين القرار (وصولا الى 4 ميكرون <) لا يمكن أن يتحقق 4 باستخدام الاستشعار عن الضاغطة / المعاينة على خوارزميات فك 11،12. أخذ العينات الضغط / الاستشعار عن توفر إطارا نظريا 13-15 الناشئة مؤخرا والتي تهدف الى استعادة إشارة متفرق من عينات أقل بكثير من ما هو مطلوب وفقا لنظرية أخذ العينات. بينما في عام الانتعاش إشارة ، من القياسات تحت عينات من مشكلة سوء المطروحة ، لفئة محددة من وظائف (أي لوظائف متفرق) ، ونظرية أخذ العينات معروفة وأساسها التمثيل مؤخرا أظهرت أن تكون فعالة جدا من حيث عدد القياسات المطلوبة ، أي يمكن ، في العام نفسه إشارة متفرق يمكن استرداد فريد من عينات قليلة جدا بالمقارنة مع نظرية أخذ العينات الكلاسيكية.
الصور التي سجلتها الفلورسنت Lensless المجهر على الرقاقة لدينا أصلا تلبية مطلب مهم من فك الضاغطة : للحصول على التطبيقات التي هي من مصلحة لهذا العمل ، مثل واسعة المجال الخلوي الفلورسنت ، نادرة خلية التحليل والتصوير عالية الإنتاجية الصغيرة المصفوفة ، ويمكن اعتبار الكائنات الفلورسنت التي تهم يكون متفرق بالفعل. لذلك ، لدينا في المجهر الفلورسنت lensless ، يمكن أن تكون على غرار فك التوزيع والقوة النسبية للبواعث الفلورسنت الموجود في جسم الطائرة باعتبارها واسعة النطاق ل 1 - قننت مشكلة المربعات التي يمكن حلها باستخدام مثلا ، والداخلية ، طريقة 2،12 نقطة. ويمكن تحسين هذه المشكلة وأعرب رياضيا على النحو التالي :
حيث | | ش | | ك = (ط ن Σ | ش ط | ك) (1 / ك) و | | ش | | ∞ = أقصى ط | ط ش |. ولذلك ، فإننا تقليل ل 1 - 2 - L تنظيما القاعدة من الفرق بين تسجيل / قياس (ذ) والمقدرة (الفأس) الصور lensfree ، حيث x و A تمثل المصدر أن يتم توزيع فك ومصفوفة قياس شكلت باستخدام PSF التجريبية للنظام ، على التوالي. ونحن أيضا استخدام وظيفة القيد إجبار التوزيع مصدر في الطائرة أن يكون الكائن غير سالب. هذه العملية التكرارية فك الضغط تنتهي قيمة التكلفة وظيفة يصل إلى قيمة التسامح محددة سلفا. تنظيم (β) والتسامح المعلمات في الوظائف العامة لتبعثر الكائن وقياس مستوى الضجيج ، والأمثل في نظامنا إلى ~ ~ βmax/10 و 0.01 على التوالي.
استنادا إلى خطة العددية المبينة أعلاه ، فك الضغط من الصور الفلورية الخام يحسن كثيرا من قدرة برنامجنا للحل الكائنات متفرق والمعارض سرعة معالجة مماثلة لوسي ريتشاردسون Deconvolution - 2. بالإضافة إلى التصوير طبقة واحدة ، يمكن الكائنات الفلورسنت الموجود في أعماق مختلفة أيضا فك وفصلها عن بعضها البعض في وقت واحد عن طريق تشغيل الخوارزمية نفسه باستخدام كل PSFs المقابلة لعمق طبقات مختلفة 2. - Pseudocoloring : على الرغم من عدم وجود قيود الأساسية ، وعرضت على الرقاقة منصة التصوير توظف في معظمها أحادية البصريات الالكترونية ذاتهاالمصفوفات التي nsor عموما توفير أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء للتصوير عينة بيولوجية. لذلك ، يتم الحصول على الصور الخام الفلورية في الرمادي الشكل ، والتي لا تحتوي على معلومات اللون الحقيقي للعينة. ويمكن التخفيف من ذلك باستخدام اللون اتفاقية مكافحة التصحر / المكمل رقائق لدينا في مجال العمارة والتصوير lensfree بحيث يتم الحصول على قنوات اللون 3 (الأحمر والأخضر والأزرق) في قياس كل lensfree الفلورسنت. من ناحية أخرى ، إذا كنت تعرف بالفعل خصائص الانبعاثات العلامات صباغة ، تنسيق الصور الرمادية الفلورية الخام لرقاقة الاستشعار أحادية اللون ، ويمكن أيضا إصداراتها فك / deconvoled يمكن تحويلها إلى صور ملونة اصطناعيا باستخدام خوارزمية pseudocoloring تنفيذها في مثل MATLAB. لهذا الغرض ، يمكن توسيع هذه الصور حصلت في الرمادي 3 الابعاد مكعبات البيانات ، حيث يمكن توليفها أي لون من الاهتمام باستخدام العوامل المناسبة وزنها في كل قناة الزائفة من المكعب البيانات. نتيجة لهذه المعالجة ، يمكن تحويل الصور أحادية اللون lensfree الفلورية (إذا كان المطلوب) لوحات متعددة القنوات التي توفر معلومات معروفة لون كائن الفلورسنت معين.
- العد الآلي خلية فلوري : بالنسبة للتطبيقات الخلوي ، لدينا أيضا بتطوير واجهة المستخدم مصمم خصيصا (انظر الشكل رقم 8) التي يمكن الاعتماد تلقائيا الكائنات الفلورسنت / الخلايا استنادا صورهم lensfree المكتسبة مع برنامجنا المجهري على الرقاقة. تجاه هذه المهمة ، يتم تطبيقها في البداية عتبة ناعمة لوحات lensfree الخام إلى تضييق المواقع المحتملة للكائنات الفلورسنت. ثم ، يتم استخدام سلسلة من المهام (regionprops خاصة) لقياس خصائص الصورة من كل منطقة فرعية من الفائدة ، مثل موقف الشكل والمساحة والكثافة. باستخدام هذه البيانات وجوه ، وتصنف الكائنات الثنائية إلى مجموعات فرعية ، مثل الخلايا ، بكسل القتلى ، فضلا عن الغبار أو الخلفية مضان السيارات. بمجرد أن يتم تصفيتها على النتيجة النهائية للregionprops ظيفة فقط لاظهار الاهتمام الخلايا ، ويمكن استخدام طول الصفيف هيكل الناتج للحصول على الاعتماد على خلية كاملة من تصوير FOV لدينا على الرقاقة lensfree.
4. ممثل النتائج :
يظهر نظرة عامة من إنشاء لدينا في الشكل (1) ، مع العديد من المكونات البصرية التي تستخدم في جمعيتها. وأوضح الملامح الرئيسية لبرنامجنا المجهري على الرقاقة في الشكل 2 ، بما في ذلك إثارة الفلورسنت والكشف ، والانعكاس الداخلي الكامل ، وكذلك الإضاءة جزئيا متماسكة للتصوير المجسم نقل على نفس المنصة. وتظهر نتائج التصوير Lensless الفلورسنت على رقاقة من خليط غير متجانس تحتوي على جسيمات مختلفة الدقيقة (4 و 10 ميكرومتر ميكرومتر الأخضر أخضر / أحمر) في أرقام 3-4. وتقدم مقارنة بين لوسي ، وريتشاردسون deconvolution الضاغطة أخذ العينات / الاستشعار عن فك مقرها في الشكل (5) لتعزيز قرار رقميا من الصور الخام lensless الفلورسنت. تمكين فك الضغط هو كميا القرار المكانية (<4 ميكرون) في الشكل رقم 6. ويتضح Lensless على رقاقة المجهر fluorescently المسمى من خلايا الدم البيضاء في الشكل 7 ، والذي يوفر أيضا مقارنة الصور التي اتخذت مع المجهر الفلورسنت التقليدية. أخيرا ، يظهر لدينا العد الآلي الكائن الفلورسنت واجهة في الشكل 8.
ويظهر الشكل 1. نظرة عامة لدينا lensless على رقاقة التصوير المتابعة مع مجموعة المكونات البصرية التي تستخدم عدة في جمعيتها.
الشكل 2. يظهر من الرسم التخطيطي على الرقاقة lensfree منصة التصوير فلوري (الصورة اليسرى). ويتحقق من خلال إثارة مضان الوجه جانب من المنشور المعيني استخدام مصدر غير متماسكة. ويرد أيضا على انشاء التجريبية لدينا على الرقاقة منصة التصوير فلوري (صورة اليمين). لقد كان امرا مثيرا من خلال واجهة المنشور ، حيث تم استخدام النفط مؤشر مطابقة لتجميع شرائح والمنشور في : كله عينة من الدم داخل شريحة ميكروفلويديك (2.5 × 3.5 × 0.3 سم الأبعاد). على ضوء رفض الإثارة بواسطة النقل البري الدولي وتصفية اللون ، تم تسجيلها فقط من انبعاث الفلورسنت من خلايا الدم المسمى بواسطة رقاقة الاستشعار لدينا اتفاقية مكافحة التصحر (KODAK 11002) عبر FOV من ~ 2.5 × 3.5 سم.
ويوضح الشكل 3. اسعة المجال lensless الفلورسنت على رقاقة التصوير من مزيج يحتوي على 4 و 10 ميكرومتر ميكرومتر الجسيمات الفلورية الخضراء. لأغراض المقارنة ، كما يتم توفير الصور 10X الهدف المجهر ، والتي تتفق تماما مع صورنا lensless الفلورسنت.
الشكل 4.
الشكل 5. يقدم مقارنة أداء deconvolution (من اليسار) لوسي ، وأخذ العينات الضغط ريتشاردسون (CS) تستند خوارزميات فك التشفير ، لتصوير مختلف ميكرومتر 10 حبة أزواج. في الصف العلوي يوضح lensless الصور الفلورية الخام. الصور أقحم في الصف العلوي تظهر مقارنات المجهر من الجسيمات نفسها التي يتم الحصول عليها باستخدام عدسة الهدف 10X. الصف الأوسط يوضح لنا نتائج فك الضغط بينما الصف السفلي يوضح النتائج deconvolution وسي - ريتشاردسون. فك CS د ، د CS ، وLR د الرجوع إلى مسافات مركز إلى مركز في صور المجهر ، lensless الصور ، والصور LR deconvolved lensless ، على التوالي.
ويوضح الشكل 6. المعالجة الرقمية للصور lensless الخام الفلورسنت. ويستخدم خوارزمية الانضغاط المعاينة يستند إلى تحقيق <4 ميكرون القرار المكانية عن طريق حل معبأة بشكل وثيق قطرها ميكرون 2 أزواج حبة. وتبين أيضا insets 40X مقارنات موضوعية المجهر ، والتي تتفق تماما مع الصور في فك الفلورسنت. د هنا يشير إلى مسافات مركز إلى مركز في صور المجهر ، بينما د CS يشير إلى مسافات مركز إلى مركز خدمات العملاء في الصور فك lensless الفلورسنت.
الشكل 7. يتضح من التصوير lensless fluorescently (SYTO 16) المسماة خلايا الدم البيضاء. يتم فك بسرعة الخام lensfree الصور باستخدام فك CS مقرها ، والتي تتفق تماما مع صورة مجهر التقليدي لنفس العينة التي يتم الحصول عليها مع عدسة الهدف 10X.
ويوضح الشكل 8. مصمم خصيصا لآلية الفرز الكائن الفلورسنت واجهة (في MATLAB).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن أظهرت وجود على منصة رقاقة المجهر الفلورسنت التي يمكن أن تحقق مثل <4μm القرار المكانية على سبيل المثال ،> 0،6-8 سم 2 حقل من رأي من دون استخدام أي عدسات أو الميكانيكية المسح الأغشية الرقيقة التدخل المرشحات. في هذه التقنية ، مع استخدام غطاء الألياف الضوئية أو تفتق أ ، يتم جمع الانبعاثات الفلورسنت من الكائنات مع مجموعة - 2D من كابلات الألياف الضوئية قبل أن يتم تسليمها إلى مجموعة أجهزة الاستشعار البصريات الالكترونية مثل اتفاقية مكافحة التصحر / المكمل رقاقة. وهذه الصور ثم اكتسبت lensfree معالجتها بسرعة لمحصول <قرار حول 4μm> 0،6-8 سم 2 مجال الرؤية من استخدام الضغط أخذ العينات / الاستشعار عن بعد مقرها فك الخوارزمية. ربما مثل هذا التعاقد على نطاق واسع في الميدان منصة التصوير الفلورسنت تكون مفيدة للغاية لالخلوي الإنتاجية العالية ، والبحوث النادرة الخلية فضلا عن تحليل ميكروأري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ألف أوزكان بامتنان بدعم من المؤسسة القومية للعلوم جائزة التوظيف ، وجائزة الباحث الشاب ONR 2009 وجائزة مدير المعاهد الوطنية للصحة ومبتكر جديد DP2OD006427 من مكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة. الكتاب نعترف أيضا بدعم من مؤسسة بيل وميليندا غيتس ، مؤسسة فودافون الأمريكتين ، وجبهة الخلاص الوطني بيش برنامج (تحت جوائز # 0754880 و0930501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-8300 | |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-11002 | |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9T031C12STCD | |
| High power LED light source | Thorlabs Inc. | M455L2-C2 | |
| High power LED driver | Thorlabs Inc. | LEDD1B | |
| Fiber coupled LED light source | Mightex | FCS-0625-000 | |
| Vacuum Pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 2, 4, 10 μm Fluospheres | Invitrogen | F-8826, F-8859, F-8836 | |
| RBS lysis buffer 1X | eBioscience | 00-4333 | |
| SYTO 16 labeling reagent | Invitrogen | S7578 | |
| Fiber-optic faceplate | Edmund Scientific | NT55-142 | |
| Fiber-optic taper | Edmund Scientific | NT55-134 | |
| Prisms | Edmund Scientific | NT47-626, NT45-403 | |
| Filters | Edmund Scientific | NT39-417 | |
| PDMS Elastomers | Dow Corning | Slygard 184 |
References
- Coskun, A. F., Su, T., Ozcan, A. Wide field-of-view lens-free fluorescent imaging on a chip. Lab Chip. 10, 824-824 (2010).
- Coskun, A. F., Sencan, I., Su, T., Ozcan, A. Lensless wide-field fluorescent imaging on a chip using compressive decoding of sparse objects. Opt. Express. 18, 10510-10523 (2010).
- Coskun, A. F., Sencan, I., Su, T., Ozcan, A. Lensfree Fluorescent On-Chip Imaging of Transgenic Caenorhabditis elegans Over an Ultra-Wide Field-of-View. PLoS ONE. 6, e15955-e15955 (2011).
- Coskun, A. F., Sencan, I., Su, T., Ozcan, A. Wide-field lensless fluorescent microscopy using a tapered fiber-optic faceplate on a chip. Analyst. , (2011).
- Seo, S. High-Throughput Lens-Free Blood Analysis on a Chip. Analytical Chemistry. 82, 4621-4627 (2010).
- Mudanyali, O. Compact, light-weight and cost-effective microscope based on lensless incoherent holography for telemedicine applications. Lab Chip. 10, 1417-1417 (2010).
- Tseng, D. Lensfree microscopy on a cellphone. Lab Chip. 10, 1787-1787 (2010).
- Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-745 (1974).
- Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. J. Opt. Soc. Am. 62, 55-59 (1972).
- Biggs, D. S. C., Andrews, M. Acceleration of iterative image restoration algorithms. Appl. Opt. 36, 1766-1775 (1997).
- Candes, E., Wakin, M. An Introduction To Compressive Sampling. Signal Processing Magazine, IEEE. 25, 21-30 (2008).
- Kim, S., Koh, K., Lustig, M., Boyd, S., Gorinevsky, D. An Interior-Point Method for Large-Scale L1-Regularized Least Squares. Selected Topics in Signal Processing, IEEE. 1, 606-617 (2007).
- Candes, E. The restricted isometry property and its implications for compressed sensing. Comptes Rendus Mathematique. 346, 589-592 (2008).
- Baraniuk, R.
- Romberg, J.
