Här beskriver vi isolering av CD133 uttrycker leverstamceller och cancer stamceller från hela murina lever, en process som kräver vävnads matsmältning, celler anrikning och flödescytometri isolering. Vi inkluderar metoder för avancerad enda cell isolering och klonal expansion.
Lever stamceller eller ovala celler, föröka vid kronisk leverskada och föreslås differentieras till både hepatocyter och cholangiocytes. Dessutom, är levern stamceller hypotes att vara prekursorer för en delmängd av levercancer, hepatocellulärt karcinom. En av de viktigaste utmaningarna för att stamceller arbete i fast organ som levern är isoleringen av en sällsynt population av celler för detaljerad analys. Till exempel, den stora majoriteten av celler i levern är hepatocyter (parenkymal fraktion), som är väsentligt större än icke-parenkymala celler. Genom att berika de specifika cellulära utrymmen i levern (dvs. parenkymal och icke-parenkymala fraktioner), och selektera för CD45-negativa celler, kan vi berika utgångspopulation av stamceller med över 600-fold.The proceduresdetailed i denna rapport tillåter en relativt sällsynt population av celler från en fast organ som skall sorteras effektivt. Denna process kan användas för att isolateliver stamceller från normala murina lever samt kroniska lever modeller skada, som visar ökad lever spridning stamceller. Denna metod har klara fördelar jämfört med vanliga immunohistokemi av frysta eller formalinfixerade lever som funktionella studier med levande celler kan utföras efter första samlokalisering experiment. För att åstadkomma det förfarande som beskrivs i denna rapport är ett samarbete med en forskningsbaserad flödescytometri kärna uppmuntras som detaljerna i FACS isolering är starkt beroende av inrättningar och goda kunskaper om grundläggande flödescytometri förfaranden. Det särskilda målet med denna process är att isolera en population av leverstamceller som kan klonalt expanderade in vitro.
Till skillnad från det hematopoietiska systemet, i vilket hematopoetiska stamceller är ansvariga för att upprätthålla en cellulär differentiering system som replacesnormal fysiologiskt omsättningen av leukocyter, röda blodkroppar och blodplättar, lever stamceller, eller vuxen lever progenitorceller, inte deltar i normal lever homeostas. 5,6 efter akut leverskada eller partiell hepatektomi, hepatocyter, som differentierade lever epitel, genomgår flera omgångar av proliferation för att ersätta den förlorade levern massa. 5,6 Endast vid kronisk skada är leverstamceller observerade celler att föröka sig. 1,5 -11 Dessa vuxna, organspecifika stamceller föreslås att differentiera i både hepatocyter och cholangiocytes. 1,5-8 Intressant, utvecklar den stora majoriteten av levercancer på bakgrunden av kronisk skada, och således levern stamceller också hypotesen att prekursorerna för en delmängd av levercancer. 2-4,12-17
On av de stora utmaningarna att stamceller arbete i levern är isolering av sällsynta populationer av celler för funktionell analys. Till exempel, den stora majoriteten av celler i levern är hepatocyter, som är väsentligt större än cholangiocytes och andra mindre icke-parenkymala celler. Genom att bryta hela levern till cellavdelningar (stora hepatocyter – parenkymal fraktion och mindre celler – icke-parenkymal fraktion), och ytterligare selektera för CD45 negativa celler (icke-hematopoetiska celler), kan vi berika start populationen av stamceller från över 600-faldigt. 1,18-21 Notera, vi inte på något sätt indikerar att CD133 + befolkningen är en 100% ren stamceller befolkningen, men klart är en heterogen population av celler med olika härstamning och återinsättning potential. En av de största begränsningarna för fältet är definitioner av stamceller och progenitorceller. Vi använder termen "stamceller" bredare i detta arbete, men i strikt definition, CD133 + icke-parencHymal celler representerar en bi-härstamning stamceller befolkningen. Med tanke på tillståndet i nuvarande stam-och stamfader forskning i levern, gör rapporten ger en utgångspunkt för utredare som är intresserade av detta område. När nya markörer uppstår, såsom EpCAM, 22,23 eller transkriptionsfaktorer, såsom Sox9, 24 kan de införlivas. Till exempel har vi funnit en ganska hög grad av överlappning mellan EpCAM + celler och CD133-celler +.
I denna rapport, detalj vi en process för stamceller isolering från normal murin lever liksom kronisk lever-modeller skada, som visar ökad lever spridning stamceller. Denna metod har klara fördelar jämfört med vanliga immunohistokemi av frysta eller formalinfixerade lever som funktionella studier med levande celler kan utföras efter isolering. 1,3,4 Det särskilda målet för denna process är att isolera en relativt ren population av celler leverstamceller som kan vara klonalt expanderade in vitro.
<p cLass = "jove_content"> Den primära begränsningen till detta förfarande är att majoriteten av isolerade celler inte kommer att vara lönsamt efter flödescytometri (se avsnitt Felsökning). Detta är resultatet av de timmar som krävs för att förbereda cellerna, och de många förfaranden som krävs för att förfina befolkningen före isolering. Om levern rötas i enkelcellsuspension för omedelbar FACS analys kommer skillnaden i storlek mellan hepatocyter och andra icke-parenkymceller effektivt FACS gate skapande omöjligt. Om levern icke-parenkymala celler används, utan eliminering av hematopoietiska celler, finns det en risk att ett betydande antal av CD133 + celler kan vara av hematopoietiskt ursprung kan förorena fraktionen. Vidare, genom bearbetning av cellerna genom Miltenyi filtret, är det endast enskilda celler och mycket små kluster av celler uppsamlas. Detta säkerställer att provet inte kommer att täppa FACS intaget nål.Alternativ för detta förfarande inkluderar mNDRING för en alternativ cellytmarkör såsom CD49f, EpCAM, eller en kombination av markörer, såsom CD133 + EpCAM + En andra publicerad rapport använder en densitetsgradient att isolera leverstamceller från en icke-parenkymal fraktionen. Denna procedur kräver en Ultra-centrifug (8000 xg), har ett betydande tid förfarandet och enligt vår erfarenhet, signifikant minskade före FACS cellulär avkastning och efter FACS livskraft. 8
Framtida experiment inkluderar en bredare genuttrycksanalys, inklusive fetala leverceller gener, såsom HNF3, HNF4α och αfp.In addition, Western blot-analys och immunocytokemi av uttryckta proteiner kan användas för att bekräfta RT-PCR-resultat av celler i odling.
En fråga att notera är senaste arbete som identifierade CD133 uttryck på celler hepatiska stellatceller. 25 Nu rutinmässigt screena våra prover för markörer för stellatceller celler (se avsnitt Felsökning) och har inte identified betydande kontaminering i våra fraktioner. Detta kan relateras till olika tekniker för lever-digerering och cellisolering. 2,3,26
Baserat på det faktum att majoriteten av celler inte kommer att vara lönsam omedelbart efter FACS isolering, rekommenderar vi att cellerna skall pläteras, antingen som bulk CD133 + celler eller enstaka celler, före användning i djur. 5-7 dagar in vitro kommer att avsevärt förbättra resultaten av tumör analys. Dessutom, med tanke på påfrestningarna i en enda cell isolering, bör detta endast göras en gång kolonier kan expanderas från bulk CD133 + isolerade celler. En mer ingående diskussion om de olika odlingsbetingelser och byggnadsställning proteiner som kan användas till kultur lever stam-och stamfaderceller har väl präglats av Lola Reid. Detta arbete ger alternativa villkor och ändringar, vilka utredarna kan införliva i sina forskningsprogram gång grundläggande isolering tekniker behärskar. 27,28 Dr Reids work ger också en mer detaljerad analys av härstamning biologi och mognad mellan celler hepatiska stamceller och stamceller.
När det gäller in vivo-tumör analys har vi haft framgång med nyligen isolerade celler och celler från klonalt expanderade CD133 + celler in vitro, främst med 1×10 6 celler. Vi har fokuserat ontwo genetiska stammar av kronisk leverskada, den MAT1a – / – och lever specifika PTEN – / – möss, och vi har utnyttjat både nakna möss och vildtyp möss som värdar för tumörtillväxt. Enligt vår erfarenhet kommer CD133 + lever stamceller bildas endast tumörer om de är isolerade från betydande modeller leverskada som är pre-maligna. Observera att tumörerna bildas av CD133 + celler allmänhet har både hepatocellulär cancer och funktioner cholangiocarcinoma, vilket tyder på en stamcell eller progenitorceller ursprung till tumörerna. 2-4,29
Uppföljning efter tumörer dokumenteras inkludes standarden patologisk analys av tumörvävnad (H & E-färgning) och immunohistokemisk färgning. Dessutom kan tumörer hackas och digererades under FACS-analys eller re-kultur. 2-4,30
Sammanfattningsvis har vi i detalj ett förfarande för isolering, expansion och grundläggande karakterisering av CD133 + leverstamceller och CD133 + cancer stamceller.
Felsökning:
CD45 kontaminering:
För steg 3, om det finns kontamination av CD45 + celler, som kan bedömas genom att lägga till en CD45-FITC AB inför FACS-analys och isolering, kontrollera att CD45 mikrokorn antikroppen inte har löpt ut och att filtratet samlas in endast när Filtret var i den magnetiska hållaren. Varje filtrat samlas under filtret inte är i den magnetiska hållaren kommer att innehålla CD45 + celler.
Lågt cellantal:
För oskadade levern, den totala number av CD133 + icke-parenkymal isolerad kan vara mindre än 10.000. Dessa celler är sällsynta i det obelastade levern. För en kronisk skada modell, såsom DDC 0,1% diet, kommer antalet att öka kraftigt till 100.000 celler. Om det totala antalet celler är betydligt lägre än dessa siffror, är en fråga att överväga FACS Ab färgning. Kontrollera att den CD133 AB inte har löpt ut, som dålig färgning kommer att resultera i en dålig avkastning. Dessutom rekommenderar vi att utföra en FACS-analys av lever icke parenkymceller för att bestämma den relativa befolkningen innan du försöker FACS isolering.
Låg cellviabilitet efter FACS:
En av de frågor om lönsamheten kan vara relaterade till hur cellerna bearbetas och under vilken tid. Helst ska hela cellen isolering förfarande steg 1-4, genomföras utan förseningar mellan steg och avslutas under samma dag. Varje betydande fördröjning mellan stegen 1-4 kommer att kraftigt minska cellviabiliteten. En andra fråga rör Cell livsduglighet kan vara relaterad till höljet tryck som används för FACS isolering. Vi rekommenderar att du använder ett lägre hölje tryck. Slutligen, när cellerna isoleras, bör de vara omedelbart pläteras, eftersom varje betydande lagring på is efter sortering kommer också att minska lönsamheten.
CD133 + icke-parenkymal heterogenitet:
Färska rapporter visar att hepatiska stellatceller celler kan också ha CD133 uttryck och ha lite plasticitet. 25 Därför kan förutom att kontrollera bi-potens gener med Albumin och Krt19, ytterligare verifiering inkludera gener associerade med stellatceller celler, såsom gliafibrillärt surt protein i vilande stellatceller celler och alfa-aktin i glatt muskulatur och desmin i aktiverade stellatceller. 3,4,26 dessutom representerar CD133 + befolkningen en bredare stamceller befolkning. Tillsatsen av en andra markör, såsom EpCAM, kan hjälpa till att förfina befolkningen ytterligare, och begränsa heterogenitet.
The authors have nothing to disclose.
Dr Rountree erkänner det nuvarande stödet från Barnens Miracle Network, National Institute of Health, K08DK080928 och R03DK088013, och American Cancer Society Research Scholar Award, MgO-11.651. Dr Rountree erkänner att detta förfarande ursprungligen utvecklats och förfinats under finansieras av Pediatric Scientist Development Program (NICHD Grant Award K12-HD00850).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
DMEM:F12 | Invitrogen | 10565-018 | With phenol red |
CD45 microbeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | |
Epidermal Growth Factor | Sigma | E4127 | |
DNase | Sigma | DN25 | 1 gram |
Collagenase D | Roche | 1088874 | |
Pronase | Roche | 0165921 | |
70 micron mesh strainer | Fisher | 352350 | |
Omniscript RT | Quaigen | 205111 | 50 reactions |
HotStarTaq | Quaigen | 203203 | |
Miltenyi LD column | Miltenyi | 130-042-901 | |
CD133-PE FACS Ab | eBioscience | 12-1331-82 | |
Laminin coated plates | BD | 354410 | 96 well |
Trypsin 0.05% EDTA | Invitrogen | 25300-354 | 100 mL |
RNeasy Micro Kit | Quaigen | 74004 | 50 columns for 5×105 cells or less |
Pharm Lyse | BD | 555899 | 10X concentration |