Summary
Nous décrivons ici l'isolement des cellules souches CD133 exprimer foie et les cellules souches du cancer du foie murin ensemble, un processus qui nécessite la digestion des tissus, l'enrichissement des cellules, et l'isolement de cytométrie en flux. Nous incluent des méthodes pour l'isolement cellulaire de pointe unique et l'expansion clonale.
Abstract
Cellules souches du foie, ou des cellules ovales, prolifèrent au cours des lésions hépatiques chroniques, et sont proposés à se différencier en hépatocytes et deux cholangiocytes. En outre, les cellules souches du foie sont suppose être les précurseurs d'un sous-ensemble de cancer du foie, le carcinome hépatocellulaire. Un des défis principaux pour enrayer le travail des cellules dans tous les organes solides comme le foie est l'isolement d'une population rare de cellules pour une analyse détaillée. Par exemple, la grande majorité des cellules dans le foie sont les hépatocytes (fraction du parenchyme), qui sont nettement plus grandes que les cellules non parenchymateuses. En enrichissant les compartiments cellulaires spécifiques du foie (c.-parenchymateuses et non parenchymateuses fractions), et en sélectionnant les cellules pour CD45 négatives, nous sommes en mesure d'enrichir la population de départ des cellules souches par plus de 600 fold.The proceduresdetailed dans ce rapport permettent de une population relativement rare de cellules d'un organe solide à trier efficacement. Ce processus peut être utilisé pour les cellules souches du foie murin isolateliver normale ainsi que les modèles des lésions hépatiques chroniques, qui démontrent la prolifération accrue des cellules du foie souches. Cette méthode a des avantages évidents sur immunohistochimie standard de foie congelé ou fixé au formol que des études fonctionnelles utilisant des cellules vivantes peut être effectuée après la première co-localisation des expériences. Pour accomplir la procédure décrite dans ce rapport, une relation de travail avec une recherche basée cytométrie de flux de base est fortement encouragée que les détails de l'isolement FACS sont fortement tributaires des instruments spécialisés et d'une solide connaissance pratique de base cytométrie en flux des procédures. L'objectif spécifique de ce processus consiste à isoler une population de cellules souches du foie qui peut être élargi par clonage in vitro.
Protocol
Toutes les solutions, les médias, les instruments, les filtres et les tubes doivent être stériles et manipulés avec une technique stérile afin de réduire le risque de contamination. Préparer tous les tampons et les médias 24 heures à l'avance et les conserver à 4 ° C.
1. La séparation du parenchyme et non parenchymateuses du foie entier
- Préparer la solution enzymatique pour la digestion en utilisant un tube de 15 cc avec bouchon à vis en 10 ml de PBS stérile contenant 5 mg collagénase, 5 mg pronase, et 1 mg DNAse.
- Euthanasier souris en utilisant établissement agréé (Institutional Animal Care et du Comité Utilisations) la méthode comme le CO 2 asphyxie. Essuyez la zone abdominale des animaux euthanasiés avec une solution d'éthanol à 70%. Utiliser des instruments stériles, de la cavité abdominale ouverte et le foie explant en-bloc. Retirer de la vésicule biliaire du foie explanté. Transfert du foie entier pour hotte à flux laminaire dans un plat stériles fermés.
- Cette procédure est terminée en une hotte à flux laminaire. En utilisant une lame de rasoir stérile, mâche du foie avec la combinaison de multiples coupes horizontales et verticales pendant 1 minute dans un plat stérile. Placer ¼ de pâte de foie émincé dans 15 cc avec tube de 10 ml de PBS avec de la collagénase, la pronase et DNAse partir de l'étape 1.1 ci-dessus. Répétez l'opération avec chaque foie émincé ¼.
- Placer les tubes avec ¼ de pâte de foie haché et des enzymes dans le bain d'eau à 37 ° C pendant 45 minutes, avec agitateur à 1-2 cycles / seconde. Essuyez les tubes avec de l'éthanol à 70% après le retrait du bain d'eau avant le transfert vers une hotte à flux laminaire.
- Cette procédure est terminée en une hotte à flux laminaire. Strain pulpe du foie digérés par 70 mailles microns de recueillir dans un plat stérile. Utiliser aliquots de 2 ml de solution stérile DMEM: F12 médias avec inactivé par la chaleur 10% de sérum de veau fœtal, rincez le filtre et l'utilisation à la fin de caoutchouc d'un piston de la seringue pour écraser la pulpe digérées à travers le filtre. Répéter 5 fois pour faire du volume total de filtrat environ 20 ml. Divisez le filtrat en 2 tubes de 15 ml d'égalité.
- Tous les transferts devrait être achevé en hotte à flux laminaire, et l'utilisation centrifugeuse réfrigérée à 4 ° C si elle est disponible. Centrifuger à 50 xg pendant 1 minute. Enregistrer surnageant # 1 et jetez parenchyme granulés. Centrifuger le surnageant # 1 à 50 xg pendant 1 minute. Enregistrer surnageant # 2 et jetez granulés. Centrifuger le surnageant # 2 à 50 g pendant 1 minute. Enregistrer surnageant # 3 et jetez granulés. Centrifuger le surnageant finale # 3 pour 180 g pendant 8 minutes pour obtenir non parenchymateuses fraction.
2. Lyse des globules rouges
Travailler dans une hotte à flux laminaire, garder les cellules froides, et les solutions utilisent refroidi à 4 ° C.
- La nuit avant la procédure, préparer rouges tampon de lyse cellulaire par dilution de la concentration des stocks 10X BD Pharm Lyse tampon avec une dilution 1:10 avec de l'eau distillée stérile. 1X solutionshould être stockées pendant 30 jours à 4 ° C.
- La nuit avant la procédure, préparer tampon Miltenyi utilisant PBS stérile, 0,5% de sérum albumine bovine, et 2mm d'EDTA. Solution de filtre à l'aide d'aspirateur filtre avec filtre de 0,45 micron. Couverture haut de l'appareil basculeur avec couvercle en plastique originale et sécurisée avec une pellicule de plastique. Storeentire unité de filtre à 4 ° C pendant 12 heures pour dégazer l'EDTA. Unité de filtrage peut être remplacé avec bouchon stérile standard après 12 heures.
- Cette procédure est terminée en une hotte à flux laminaire. L'utilisation d'un tube de 5 ml stériles, rétablir la suspension non parenchymateuses granules de l'étape 1.6 ci-dessus dans 1 ml de tampon dilué 1X rouge sang lyse cellulaire de 2,1 ci-dessus. Boucher le tube pour le transfert hors de la hotte à flux laminaire.
- Doucement vortex pour 5 secondes et incuber pendant 15 minutes à 4 ° C à l'abri de la lumière.
- Centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes.
- Cette procédure est terminée en une hotte à flux laminaire. Jeter les globules rouges lysés dans le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon Miltenyi glace froide et stérile.
- Centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes.
- Cette procédure est terminée en une hotte à flux laminaire. Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon Miltenyi glace froide et stérile.
- Retirer 10 pl de suspension cellulaire PBS et ajouter 10 ul Tryan bleu. Comptez-parenchymateux remainingnon cellules en utilisant hémocytomètre.
3. CD45 déplétion des cellules hématopoïétiques de la fraction non parenchymateuses
Travailler dans une hotte à flux laminaire, garder les cellules froides, et les solutions utilisent refroidi à 4 ° C.
- Suspendre les cellules dans 100 ul de tampon Miltenyi par 107 cellules jusqu'à 108 cellules totales.
- Appliquer 20 uL Miltenyi CD45 microbille pour chaque 107 cellules et incuber à 4 ° C pendant 15 minutes.
- Ajouter 2 ml supplémentaires Miltenyi tampon et centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes. Retirer le surnageant. Re-suspendre le culot cellulaire (jusqu'à 108 cellules au total) dans 1 ml de tampon Miltenyi.
- Dans hotte à flux laminaire, les cellules du filtre à l'aide Miltenyi LD colonne magnétique. Commencez par placer la colonne dans le support magnétique (MidiMACS Miltenyi ou QuadroMACS). Placez stériles de 5 ml tube-dessous du filtre pour attraper filtrat. Préparer la colonne en chargeant Milte 2 mlnyi tampon.
- Une fois pré-filtre de lavage est terminé, charger les cellules sur la colonne LD. Une fois la suspension cellulaire est dans la colonne, ajouter 1 ml de tampon Miltenyi et répétez 1 ml de tampon de lavage Miltenyi 2 fois supplémentaires. NE PAS utiliser le piston fourni avec colonne pour augmenter la vitesse de filtration. Ne recueillir filtrat lorsque le filtre placé dans le support magnétique.
- Centrifuger le filtrat recueilli d'environ 5 ml (la colonne détient la participation restante de 1 ml) de CD45-appauvri non parenchymateuses cellules à 200 xg pendant 5 minutes. Jeter la colonne avec le CD45 conservé cellules positives.
4. L'isolement cytométrie de flux de cellules positives CD133
- Préparez le support de cellules ovales. Utilisez 01h01 milieu DMEM: F12 avec inactivé par la chaleur du sérum de veau foetal 10% comme base, et ajouter de l'insuline (1 pg / ml), HEPES (5 mol / L) et pénicilline / streptomycine (1% en volume / volume). Solution de filtre à l'aide d'aspirateur filtre avec filtre de 0,45 micron.
- Re-suspendre les cellules dans un tampon de Miltenyi à 100 ul par 10 7 cellules. Ajouter 2 ul de CD133-PE anticorps conjugués. L'utilisation d'un deuxième groupe de cellules, incuber avec des IgG-PE anticorps conjugué comme un contrôle. Conservez un troisième groupe de cellules sans coloration comme un contrôle non coloré pour FACS.
- Incuber à 4 ° C pendant 15 minutes dans l'obscurité. Re-suspendre en 2 ml tampon de coloration. Centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes. Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon Miltenyi.
- Cette étape est réalisée en utilisant la norme de débit des procédures de tri cellulaire par cytométrie, qui peuvent être spécifiques institution. En utilisant des cellules non colorées et IgG cellules PE tachés, ajuster les paramètres pour le tri gating optimisée de CD133 + population de cellules. PE (R-Phytoerythrin) peuvent généralement être utilisés avec n'importe quel cytomètre en flux qui a un laser qui émet à 488 nm. Le pic d'émission pour le PE est de 575 nm et est détecté dans le canal FL-2.
Remarque: L'utilisation d'un BD ou BD FACS Calibur FACS Vantage machines, avec le programme Cell Quest pour la collecte des données, nous utilisons Vue avant Scatter Scatter et secondaires dans l'échelle logarithmique pour identifier les populations de cellules, avec la diffusion latérale à 250. FL1 et FL2 sont à la fois en échelle logarithmique et mettre à 550. Ces paramètres fournissent un lieu de départ initial pour voir le foie non parenchymateuses cellules, et sont ajustés au besoin basée sur l'intensité de coloration des populations positives et négatives. - Isoler la population CD133 + cellule en utilisant CD133 + porte et de recueillir les cellules de milieux stériles cellulaire filtré.
5. Les méthodes de culture cellulaire
- Centrifuger les cellules FACS recueillies à 200 xg pendant 5 minutes. Re-suspendre le culot cellulaire dans les médias cellules ovales, avec environ 5000 cellules par ml. Peut commencer avec des concentrations plus élevées, jusqu'à 50 000 cellules / ml pour les premières expériences, et de réduire en améliore la technique et la viabilité cellulaire et améliore le rendement global.
- Cellules plaque sur BD Biocoat laminine revêtement des plaques de 96 puits à l'aide 1000 cellules / cm 2. Placer dans humidifié incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5% de CO 2. Après 24 heures, ajouter le facteur de croissance des hépatocytes (50 ng / nl) et facteur de croissance épidermique (20 ng / ml).
- Pour des cellules individuelles, d'isoler les cellules directement dans 50 ul de médias cellules ovales dans chaque puits d'une 96 puits laminine plaque revêtue. Utiliser une seule cellule FACS paramètres de sélection rigoureuse d'une cellule positive uniquement. Après 24 heures, ajouter 50 ul de médias cellules ovales avec HGF et EGF comme ci-dessus à l'étape 5.2. Changement des médias totalement après 5-7 jours.
- Une fois les colonies en expansion sont supérieurs à 50% confluentes, qui survient habituellement après 2 semaines, selon le nombre total de cellules plaqué et la viabilité cellulaire, les cellules peuvent être réparties comme ci-dessous 01h03.
- Fractionner les cellules en utilisant la trypsine 0,05%-EDTA. Appliquez juste assez pour couvrir de fond de puits, 50-100 ul / puits sur la plaque de 96 puits. Placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 3-5 minutes.
- Ajouter 100 uL de médias dans chaque puits et le transfert de tous les liquides à 5 ml tube. Ajouter 1 ml de milieu dans chaque tube et centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes.
- Re-suspendre les cellules dans la plaque de médias dans la laminine plat revêtu, en utilisant des cellules de 1 et à l'assiette en 3 nouveaux puits (ratio 1:3).
6. Confirmation de la bi-potentiel de l'état en utilisant la RT-PCR
Cette procédure est détaillée dans le manuel de RNeasy protocole, qui est fourni avec le kit RNeasy.
- Utilisez RNeasy colonnes micro pour 96 colonies de plaques à puits. Aspirer des milieux de culture de chaque puits. Ajouter 75 ul tampon RLT (du kit RNeasy) directement à chaque puits. Plaque inférieure Gratter avec spatule en caoutchouc stérile. Pipettelysate en micro-tube à centrifuger et le mélange au vortex pendant 1 minute. Ajouter l'éthanol à 70% à lysats et mélanger par pipetage.
- Transférer la solution à la colonne RNeasy placée dans un tube collecteur de 2 ml (comme fourni dans le kit RNeasy) et centrifuger dans des micro-centrifugeuse pendant 15 secondes à 10000 rpm. Jeter élué filtrat.
- Réutilisation du tube de collecte. Ajouter 350 pi de tampon RW1 (RNeasy Kit) dans la colonne RNeasy et centrifuger pendant 15 secondes à 10000 rpm pour laver la colonnemembrane. Jeter lavez éluées.
- Ajouter 10 uL solution de DNase I à 70 pi de tampon RDD (tous deux fournis dans le kit RNeasy). Ajouter 80 ul du tampon DNase I mélange d'incubation RDD à la membrane colonne RNeasy et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.
- Ajouter 350 pi de tampon RW1 (RNeasy kit) à la colonne RNeasy et centrifuger pendant 15 secondes à 10000 rpm pour laver la membrane. Jeter lavez élue et le tube collecteur.
- Placer la colonne RNeasy dans un nouveau tube collecteur de 2 ml (fourni dans le kit RNeasy). Ajouter 500 pi de tampon RPE (RNeasy Kit) dans la colonne RNeasy et centrifuger pendant 15 secondes à 10000 rpm pour laver la membrane. Jeter lavez éluées.
- Préparer l'éthanol à 80% en utilisant l'eau sans RNase (RNeasy Kit). Ajouter 500 ul d'éthanol à 80% à la centrifugeuse columnand RNeasy pendant 2 minutes à 10000 rpm. Jeter lavez éluées.
- Placer la colonne RNeasy dans un nouveau tube collecteur de 2 ml (RNeasy Kit) et centrifuger à pleine vitesse pendant 5 minutes. Jeter tout laver élue et le tube collecteur.
- Placer la colonne RNeasy dans un nouveau tube collecteur de 1,5 ml (kit RNeasy). Ajouter 14 uL d'eau sans RNase (RNeasy Kit) dans le centre de la membrane de la colonne et centrifuger pendant 1 minute à pleine vitesse. Recueillir le filtrat avec l'ARN purifié et le transfert à la glace en cas de création d'ADNc immédiatement ou conserver au moins 80 ° C pour une utilisation future.
- La transcription inverse en utilisant Omniscript.Dilute inhibiteur de RNase à une concentration finale de 10 unités / uL dans glacée RT 1x tampon. Vortex pendant 5 secondes, et centrifuger impulsions pendant 5 secondes. Préparer un master mix frais sur la glace en fonction de la page 13 de Omniscript protocole. Vortex pendant 5 secondes, et centrifuger impulsions pendant 5 secondes. Recommander à préparer un volume de mastermix 10% supérieure à celle requise pour le total requis pour toutes les réactions.
- Ajouter ARN modèle pour les tubes individuels contenant mélange maître. Vortex pendant 5 secondes, et centrifuger impulsions pendant 5 secondes. Incuber pendant 60 min à 37 ° C.
- L'amplification par PCR des hépatocytes (albumine) et cholangiocytes gènes spécifiques en utilisant l'ADN polymérase HotStarTaq. Préparer le mélange de réaction par page 15 du protocole de HotStarTaq livre. Recommander diluer amorces d'actions à la concentration de 20 h / ul, et avec 1 ul / réaction tube utilisé pour amorces avant et arrière. Selon le nombre de cellules initialement utilisé pour l'extraction de l'ARN, nous recommandons divisant ADNc final entre 3 tubes de réaction (β-actine pour le contrôle du chargement, l'albumine, et KRT19) pour commencer.
- Conception d'amorce de PCR est indiquée au tableau 1.
- Placer les tubes de réaction dans un thermocycleur. Recommander programme suivant pour les premières expériences: 95 ° CFOR 15 minutes x 1 cycle suivi par 95 ° C pendant 30 secondes, 55 ° C pendant 30 secondes, 72 ° C pendant 30 secondes x 35 cycles, suivis par 72 ° C pendant 10 minutes.
- Les produits de PCR sont analysés en utilisant le bromure d'éthidium imprégné gel d'agarose.
7. Confirmation du potentiel tumoral des cellules souches CD133 +
- Cette procédure peut être fait avec cellules fraîchement isolées de l'étape 4 ou en utilisant des cellules qui ont été cultivés à partir de l'étape 5. Nous vous recommandons d'effectuer les premières expériences avec des cellules cultivées, comme les cellules fraîchement isolées auront réduit la viabilité et le rendement réduit.
- Trypsiniser cellules à l'aide de trypsine-EDTA 0,05% de l'étape 5.5 ci-dessus. Après 3-5 minutes d'incubation à 37 ° C, ajouter 100 uL des médias dans chaque puits et le transfert de tout le liquide de chaque puits individuels aux tubes de 5 ml (1 bien = 1 tube). Ajouter 1 ml de milieu dans chaque tube et centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes.
- Re-suspendre les cellules dans 1 ml de PBS glacé. Retirer 10 pl de suspension cellulaire PBS et ajouter 10 ul bleu trypan. Utiliser exclusion du bleu trypan, déterminer le nombre de cellules vivantes. Si vous utilisez FACS des cellules isolées, le nombre de cellules est déterminé par le comte d'isolation par FACS.
- Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 minutes et re-suspendues dans du PBS à une concentration de 1 x 10 6 vivons cellules/100 ul. Ajouter 100 ul Matrigel. Six semaines vieilles souris immunodéficientes Nude ont été injectées par voie utilisant l'aiguille 28 gague. Injecter 1 x 10 6 cellules dans 200 ul par site.
- Les souris sont surveillés pour la croissance tumorale quotidienne. Une fois les tumeurs forme, généralement après 3-4 semaines d'incubation, le volume tumoral est mesuré en utilisant des étriers (hauteur x longueur x largeur).
8. Les résultats représentatifs:
De la normale, le foie murin sain, le rendement attendu cellulaire des cellules CD133 + tige de foie est de 1000 à 5000 par le foie. Ces cellules sont relativement rares dans le foie au repos et ne se développe pas bien dans la culture. Nous ne recommandons pas d'utiliser l'analyse seule cellule du foie normal et le rendement des cellules viables qui permettront d'élargir est extrêmement faible.
Pour les foies avec des blessures chroniques importantes, telles que l'alimentation CDD de 0,1% pendant 6 semaines 1 ou modification génétique entraînant des blessures chroniques, comme l'MAT1a - / - ou Pten spécifique du foie - / - souris, 2-4 le nombre attendu de celaugmente ls isolés, avec un maximum de 100 000 cellules isolées / foie (figure 2). Si en utilisant des modèles génétiques, les savoirs du taux de tumeurs spontanées est critique, car ces procédures pour l'isolement des cellules du foie tige doit être réalisée dans les tumeurs des animaux libres. Par exemple, si l'MAT1a - / - modèles de formulaires tumeurs spontanées à 18 mois, nous vous recommandons d'utiliser des animaux au plus tard 15-16 mois, préalable à toute tumeurs spontanées signalés.
Isolement des cellules isolées à partir de modèles blessure chronique donnera plusieurs (3-9 colonies/96 plaque bien) qui étendent les colonies de cellules uniques une fois la procédure est maîtrisée, et la viabilité cellulaire est assurée. La figure 3 présente des images à contraste de phase représentative des colonies issues de simples cellules CD133 + élargi après 7 jours.
Confirmation de la bi-potentiel d'état est effectuée à l'aide d'albumine et de Krt19 RT-PCR. Colonies de cellules élargi unique de démontrer à la fois l'expression des marqueurs des hépatocytes (albumine) et cholangiocytes (Krt19). La figure 4 montre le potentiel d'expression bi-à partir de trois colonies isolées, avec environ 25 cellules / colonie à 7 jours.
CD133 + cellules souches du foie normal et des lésions hépatiques induites chimiquement (par exemple, la DDC alimentation de 0,1% pendant 6 semaines) ne seront pas former des tumeurs chez la souris nude. CD133 + cellules souches à partir de modèles spécifiques génétique (MAT1a - / - ou Pten spécifique du foie - / - souris) va former des tumeurs chez la souris nude, si isolée fin à la fin de la phase de pré-tumorale des blessures chroniques. Ce phénotype tumoral formant actuellement identifié comme une cellule souche du cancer 2-4 Pour exemple, le MAT1a -. / - Souris former des tumeurs du foie spontané à 18 semaines d'âge. CD133 + cellules souches hépatiques isolées à 15-16 semaines, lors d'une phase de blessure chronique tardive de la maladie du foie, va former des tumeurs chez la souris nude. La figure 5 montre les tumeurs représentant de l'injection bilatérale de 1 x 10 6 cellules élargi in vitro à partir des cellules simples + CD133 souches hépatiques.
| Gene | Amorce sens | Amorce antisens |
| β-actine | 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' | 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 ' |
| L'albumine | 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' | 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 ' |
| Kératine 19 | 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' | 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 ' |
Tableau 1: conception d'amorce pour la RT-PCR
Figure 1: Schéma global des méthodes.
Figure 2: CD133 + cellules souches identifiées dans le foie hautement enrichi CD45 appauvri non parenchymateuses du foie fraction de contrôle indemne de souris de type sauvage démontre 0,4% des cellules CD133 + dans le CD45 hautement enrichi appauvri non parenchymateuses fraction.. Dans la génétique knock-out MAT1a - / -, qui est un modèle de lésion hépatique chronique, la population augmente de 10 fois CD133 ou plus dans la même fraction hautement enrichi.
Figure 3: Expansion des colonies de cellules CD133 + simple clones en contraste de phase des images de quatre colonies dérivées de cellules CD133 + simple élargi sur la laminine revêtement des plaques 96 puits..
Figure 4:. Expression des gènes potentiels de Bi-CD133 + cellule souches hépatiques colonies clonale élargi au jour 7, les colonies sont d'environ 25 cellules. L'expression des gènes démontre l'expression de marqueurs marqueurs hépatocytaires et de l'albumine cholangiocytes Krt19, confirmant bi-potentiel statut de cellules CD133 +.
Figure 5: CD133 + cellules souches du foie former des tumeurs chez la souris nude Les flèches indiquent les tumeurs à croissance de 4 semaines après 6 cellules CD133 + 1x10 injectés à partir MAT1a - / - modèle.. CD133 + cellules de la toxine du foie blessures induites chroniques, tels que CCl 4 ou 0,1% DDC alimentation, ne pas former des tumeurs. La formation des tumeurs est utilisé pour identifier un potentiel malin, ou le phénotype des cellules souches cancéreuses au sein de la population de cellules souches.
Discussion
Contrairement au système hématopoïétique, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont responsables de maintenir un système de différenciation cellulaire qui replacesnormal physiologiques turn-over des leucocytes, des globules rouges et de plaquettes, de cellules souches du foie, ou un adulte les cellules progénitrices du foie, ne participent pas au foie normal homéostasie 5,6. Après une lésion hépatique aiguë ou une hépatectomie partielle, les hépatocytes, l'épithélium du foie différenciées, subissent plusieurs cycles de multiplication pour remplacer la masse du foie a perdu 5,6. Seulement pendant des blessures chroniques sont des cellules souches du foie observées à proliférer. 1,5 -11 Ces adultes, les cellules souches d'organes spécifiques sont proposées pour se différencier en hépatocytes et deux cholangiocytes. 1,5-8 intéressant, la grande majorité des cancers du foie se développe sur fond de blessures chroniques, et donc les cellules souches du foie sont également émis l'hypothèse d'être les précurseurs d'un sous-ensemble de cancer du foie. 2-4,12-17
Un des défis majeurs pour enrayer le travail des cellules dans le foie est l'isolement des populations de cellules rares pour l'analyse fonctionnelle. Par exemple, la grande majorité des cellules dans le foie sont les hépatocytes, qui sont nettement plus grandes que cholangiocytes et autres petits cellules non parenchymateuses. En brisant le foie entier dans des compartiments cellulaires (hépatocytes grands - fraction du parenchyme et des cellules plus petites - non parenchymateuses fraction), et encore la sélection des cellules CD45 négatives (non-cellules hématopoïétiques), nous sommes capables d'enrichir la population de départ de cellules souches par plus de 600 fois. 1,18-21 Fait à noter, nous sommes en aucun cas ce qui indique que la population CD133 + est un 100% de la population de cellules souches pures, mais représente clairement une population hétérogène de cellules, avec la lignée différente et le potentiel de repopulation. Une des principales limites de ce champ est la définition des cellules souches et cellules progénitrices. Nous utilisons les "cellules souches" terme plus largement dans ce travail, mais dans une définition stricte, CD133 + non parenchymateuses cellules représentent une population progénitrices bi-lignée. Étant donné l'état de cellules souches progénitrices et des recherches actuelles dans le foie, ce rapport fournit un point de départ pour les enquêteurs qui sont intéressés dans ce domaine. Comme de nouveaux marqueurs émergent, tels que EpCAM, 22,23 ou des facteurs de transcription, tels que Sox9, 24 ils peuvent être incorporés. Par exemple, nous avons trouvé un taux assez élevé de chevauchement entre les cellules EpCAM + et CD133 + cellules.
Dans ce rapport, nous détaillons un processus d'isolement de cellules souches du foie murin normale ainsi que les modèles des lésions hépatiques chroniques, qui démontrent une prolifération accrue des cellules du foie souches. Cette méthode a des avantages évidents sur immunohistochimie standard de foie congelé ou fixé au formol que des études fonctionnelles utilisant des cellules vivantes peut être effectuée après l'isolement. 1,3,4 L'objectif spécifique de ce processus consiste à isoler une population relativement pure de cellules souches du foie qui peut être élargi par clonage in vitro.
La principale limitation de cette procédure est que la majorité des cellules isolées ne sera pas viable après la cytométrie de flux (voir la section Dépannage). Ceci est le résultat des heures requises pour préparer les cellules, et les nombreuses procédures nécessaires pour affiner la population avant l'isolement. Si le foie est digéré en suspension seule cellule d'analyse FACS immédiat, la différence de taille entre les hépatocytes et d'autres cellules non parenchymateuses se rendre effective la création porte FACS impossible. Si le foie non parenchymateuses cellules sont utilisées, sans élimination des cellules hématopoïétiques, il ya un risque qu'un nombre significatif de cellules CD133 + peut être d'origine hématopoïétique peut contaminer la fraction. Par ailleurs, en traitant les cellules à travers le filtre Miltenyi, seulement des cellules individuelles et des grappes très petit nombre de cellules sont collectées. Cela garantit que l'échantillon ne sera pas obstruer l'aiguille d'admission par FACS.
Alternatives pour cette procédure incluent la modification de tout marqueur de surface cellulaire de remplacement, comme CD49f, EpCAM, ou une combinaison de marqueurs, tels que CD133 + + EpCAM Un deuxième rapport publié utilise un gradient de densité afin d'isoler les cellules souches du foie d'une fraction non parenchymateuses. Cette procédure nécessite une centrifugeuse ultra-(8000 xg), ajoute beaucoup de temps à la procédure, et dans notre expérience, a réduit significativement le rendement de pré-FACS cellulaires et post-FACS viabilité. 8
Les expériences futures incluent une gamme plus large de l'analyse d'expression génique, y compris les gènes du foie fœtal, tels que HNF3, HNF4α, et plus αfp.In, analyse Western blot et immunocytochimie des protéines exprimées peut être utilisée pour confirmer les résultats de RT-PCR de cellules en culture.
Une question à noter est que les travaux récents identifié CD133 expression sur les cellules étoilées du foie. 25 Nous avons maintenant un dépistage systématique de nos échantillons pour les marqueurs des cellules étoilées (voir section Dépannage), et n'ont pas d'identitéentified contamination importante dans nos fractions. Ceci peut être lié à différentes techniques de la digestion du foie et de l'isolement cellulaire. 2,3,26
Basé sur le fait que la majorité des cellules ne sera pas viable immédiatement après l'isolement FACS, nous recommandons que les cellules soient plaqués, soit en vrac CD133 + des cellules ou des cellules isolées, avant de l'utiliser chez les animaux. 5-7 jours in vitro de manière significative à améliorer les résultats de l'analyse de la tumeur. En outre, étant donné les rigueurs de l'isolement cellulaire unique, cela ne devrait être effectuée une fois les colonies peuvent être étendues à partir CD133 + en vrac des cellules isolées. Une discussion plus approfondie des conditions de culture différentes et des protéines d'échafaudage qui peuvent être utilisées pour endiguer le foie et les cellules progénitrices de la culture a été bien caractérisé par Lola Reid. Ce travail offre des conditions alternatives et des modifications qui les enquêteurs peuvent intégrer dans leur programme de recherche une fois que les techniques d'isolation de base sont maîtrisées. 27,28 Dr Travaux de Reid fournit également une analyse plus détaillée de la biologie et de la lignée de maturation entre les cellules souches et de progéniteurs hépatiques commis.
En termes de l'analyse des tumeurs in vivo, nous avons eu du succès en utilisant cellules fraîchement isolées et des cellules de clonage élargi CD133 + cellules in vitro, utilisant principalement 1x10 6 cellules. Nous avons concentré les souches génétiques ontwo de lésion hépatique chronique, l'MAT1a - / - et PTEN spécifique du foie - / - souris, et nous avons utilisé deux souris nude et souris de type sauvage comme hôtes pour la croissance tumorale. Dans notre expérience, les cellules CD133 + tige du foie ne forment des tumeurs si elles sont isolées à partir des modèles des lésions hépatiques importantes qui sont pré-malignes. Notez que les tumeurs formées à partir des cellules CD133 + ont en général un carcinome hépatocellulaire et des fonctionnalités à la fois le cholangiocarcinome, suggérant une cellule souche ou d'origine de cellules progénitrices de la tumeur. 2-4,29
Le travail de suivi après les tumeurs sont documentés comporte en standard d'analyse pathologique des tissus tumoraux (coloration H & E) et la coloration immunohistochimique. En outre, les tumeurs peuvent être hachée et digérées pour l'analyse de FACS ou re-culture. 2-4,30
En conclusion, nous avons une procédure détaillée pour l'isolement, l'expansion et la caractérisation de base des cellules CD133 + souches hépatiques et CD133 + cellules souches cancéreuses.
Dépannage:
CD45 contamination:
Pour l'étape 3, s'il ya contamination du CD45 des cellules +, qui peut être évaluée par l'ajout d'un Ab CD45-FITC avant analyse FACS et l'isolement, vérifiez que l'anticorps CD45 microbille n'est pas expiré et que le filtrat a été recueilli seulement pendant que la filtre a été dans le support magnétique. Toute filtrat recueilli alors que le filtre n'est pas dans le support magnétique contient des cellules CD45 +.
Faible nombre de cellules:
Pour le foie indemne, le nombre total de cellules CD133 + non parenchymateuses isolées peut être inférieur à 10 000. Ces cellules sont rares dans le foie au repos. Pour un modèle de blessures chroniques, comme le régime alimentaire CDD de 0,1%, le nombre va augmenter fortement à 100 000 cellules. Si le nombre total de cellules est nettement inférieur à ces chiffres, une question à considérer est la coloration FACS Ab. Vérifiez que le CD133 Ab n'est pas expiré, que la coloration pauvres se traduira par un faible rendement. Aussi, nous vous recommandons d'effectuer une analyse FACS de foie non parenchymateuses cellules pour déterminer la population relative avant l'isolement FACS tentant.
La viabilité des cellules après la Basse FACS:
Un des problèmes de viabilité peut être liée à la façon dont les cellules sont traitées et sur quelle période. Idéalement, la procédure d'isolement cellule entière, les étapes 1-4, doit être menée sans délais entre les étapes et terminé dans la même journée. Tout retard important entre les étapes 1-4 de réduire considérablement la viabilité cellulaire. Une deuxième question liée à la viabilité des cellules peut être liée à la pression gaine utilisée pour l'isolation par FACS. Nous vous recommandons d'utiliser une pression inférieure de la gaine. Enfin, une fois les cellules sont isolées, elles doivent être immédiatement plaquée, comme tout système de stockage important sur la glace après le tri permettra également de réduire la viabilité.
CD133 + non parenchymateuses hétérogénéité:
Des rapports récents indiquent que les cellules étoilées du foie peuvent aussi avoir CD133 expression et avoir une certaine plasticité. 25 Par conséquent, en plus de vérifier la puissance bi-gènes avec l'albumine et de Krt19, une vérification supplémentaire peut inclure les gènes associés avec des cellules étoilées, comme fibrillaire gliale acide en protéines cellules étoilées de repos et l'actine musculaire lisse alpha-et la desmine dans les cellules étoilées activées. 3,4,26 En outre, la population CD133 + représente une population plus large progénitrices. L'ajout d'un deuxième marqueur, comme EpCAM, peut aider à affiner davantage la population, et l'hétérogénéité limite.
Disclosures
Dr Rountree reçoit un soutien de recherche de Pharmacie de Bayer. Drs. Ding et Crooks et Mme Dang et Mme VanKirk n'ont aucune divulgation à signaler.
Acknowledgments
Dr Rountree reconnaît le soutien actuel du Réseau Enfants-Santé, Institut National de la Santé, et de K08DK080928 R03DK088013, et la Société américaine du cancer Research Scholar Award, MGO-11651. Dr Rountree reconnaît que cette procédure a été initialement développé et affiné tout financé par le Programme de développement scientifique en pédiatrie (NICHD Grant Award K12-HD00850).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 10565-018 | With phenol red |
| CD45 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma-Aldrich | H1404 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | DN25 | 1 gram |
| Collagenase D | Roche Group | 1088874 | |
| Pronase | Roche Group | 0165921 | |
| 70 micron mesh strainer | Fisher Scientific | 352350 | |
| Omniscript RT | Qiagen | 205111 | 50 reactions |
| HotStarTaq | Qiagen | 203203 | |
| Miltenyi LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| CD133-PE FACS Ab | eBioscience | 12-1331-82 | |
| Laminin coated plates | BD Biosciences | 354410 | 96 well |
| Trypsin 0.05% EDTA | Invitrogen | 25300-354 | 100 mL |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | 50 columns for 5x105 cells or less |
| Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | 10X concentration |
References
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