播种钛方法的血液接触与自体细胞和生物材料测试的生物相容性描述。此方法使用内皮祖细胞和钛管,手术植入分钟内接种于猪腔静脉。这种技术是适应许多其他的植入式生物医疗设备。
植入式心血管设备制造人造材料(如钛(Ti),膨体聚四氟乙烯),构成了血栓形成 1,2,3的风险的。我们已经开发出一种方法,以符合人类或猪的自体血源性内皮祖细胞(EPCs)4钛管的内表面。通过植入含有猪内皮祖细胞在猪的下腔静脉(IVC)的融合层的钛管,我们测试的种子细胞表面的一个大型的动物模型血栓环境改善的生物相容性和,它比裸露的金属表面未修改5,6,7( 图1)。这种方法可用于endothelialize分钟内植入的设备和测试他们体内的抗血栓功能。
外周血获得50公斤约克夏猪和单核细胞比例的培养,分离出内皮祖细胞 4,8 。钛管(9.4毫米ID)被预先切分为三个4.5厘米的纵向部分,并用热缩管重组。建一个播种设备,允许钛管缓慢旋转。
我们进行了剖腹探查和外部猪小肠和膀胱。夏普和钝性分离其右侧肾动脉近端远端的分叉skeletonize从下腔静脉。钛管,然后充满10 RPH x 30分钟自体荧光标记EPC悬挂和旋转,实现统一的细胞涂层 9 。 100 USP /公斤肝素管理后,下腔静脉和腰静脉两端被夹住。一个4厘米veinotomy的执行和设备中插入和充满磷酸盐缓冲液。由于veinotomy 4-0普理灵连续缝合关闭,一个钳去除空气的下腔静脉。在该过程结束时,筋膜0 – PDS(polydioxanone缝合)近似,皮下空间封闭2-0薇乔和皮肤装订关闭。
经过3 – 21天,猪安乐死,explanted EN -块和固定设备。被拆卸的钛管,内表面用荧光显微镜成像。
我们发现,裸露的金属钛管完全闭塞,而EPC种子管仍然专利。此外,我们能够证明血液接触的内表面上的内皮祖细胞融合层。
最后,我们的技术可用于endothelialize与自体内皮祖细胞在几分钟内植入的钛管,以防止血栓的设备。我们的手术方法可用于测试改进这种经过修改的设备,用最少的失血和EPC种子表面中断的生物相容性。
细胞播种钛管这里介绍的方法,使医生和科学家,以快速和均匀endothelialize血液接触的植入装置的表面。既然我们孤立和扩大从外周血内皮祖,没有大的侵入过程是必需的收获这些细胞。此外,内皮祖细胞是自体,因此,任何免疫反应的细胞种子植入的风险被淘汰。不仅对钛管,但可以利用许多其他的生物材料,心血管内科利用他的协议中所表现出的原则。
在本议定书中的关键步骤是钛管细致的清理,我们发现任何污染物妥协细胞黏附贴壁膜。此外,一个缓慢的旋转速度(管直径成反比),是在播种过程中至关重要,这样内皮祖可以慢慢解决,并坚持到表面钛管。
我们立即播种前植入的方法避免了不切实际的体外培养时间;细胞坚持个别及后在体内形成一个融合的表,避免栓塞的可能性,如纸,紧随流重新建立。我们以前的研究表明,一旦内皮祖已成长为一个融合层,他们使他们坚定不移地坚持一个细胞外基质,另外尽量减少任何可能脱落的内皮细胞表。虽然栓塞脱离的可能性不能完全排除,这似乎是多方面的低比整个设备的表面血栓形成的风险,问题,这种疗法旨在防止。
我们的方法植入到低剪切,下腔静脉血栓环境利用研究血液相容性及血栓形成的设备5,6的一个最值得信赖的大动物模型。请注意,所有的动物护理和实验是在按照国家的关怀和使用实验动物的健康指引研究所和杜克大学机构动物护理和使用委员会的批准后,才进行。
为了成功地利用这种植入方法来测试的生物材料和设备,重要的是要耐心skeletonize下腔静脉段和结扎静脉分支血管都在准备,设备插入,如设备周围出血,没有在一个“假腔”起源。另一个关键的一步是添加到设备管腔内管表面上的细胞保持湿润,在封闭的veinotomy和再灌注前发起的DPBS。如果设备不能被发现在植入的位置,它可能已迁移的“上游”的下腔静脉。这是可以预防的配售缝合(4 – O普理灵)通过静脉壁,并通过2 – 3毫米的PVC管材管部分,因此是牢牢固定在其目前的位置。如果研究者有困难找到了荧光标记的细胞后,在其他专利的管explantation图8所示,它很可能作为一个统一的工作表,这些细胞已去皮。这是可以预防的很温柔的清扫周围静脉和显示3钛管段组装,后固定管静脉。
我们的技术提供了概念证明,通过EPC的播种,以防止心血管设备血栓。这项技术可用于在内衬与病人自身内皮祖细胞的“生源”植入发展。在我们的猪动物模型的可行性研究到临床实践这种“个性化药物”朝翻译的第一个步骤提供。
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢他们的宝贵意见成像钛节和双子座生物制品莱卡微系统提供在这项研究中所使用的猪血清。我们也想感谢授予NIH的支持“自体的EPC的衬里,以改善循环系统的生物相容性协助设备”,RC1HL099863 – 01。此外,我们为国家科学基金会研究生研究奖学金的亚历山德拉Jantzen的支持表示感谢。我们还要感谢协助手术过程中的许多方面和我们研究动物的处理,乔治快速,麦克Lowe和Ianthia帕克。史蒂芬欧文一直是无价的,在许多地方我们播种设备的加工和切割钛管。
Reagent | Company Name | Catalogue Number | Comments |
Acepromazine | Boehringer-Ingelheim | BIC670025 | NAC# 10280002 |
Alconox Powered Precision Cleaner | Alconox | 1104 | |
Balfour Surgical Retractor | Adler | N/A | |
Baytril | Bayer | APVMA 46028/0705 | |
Butterfly Needle (19G) | Terumo | SV19CLK | |
Chlorhexidine | 3M | 9200 | |
Clamps (45-degree) | Aesculap | FC339T | |
DPBS (-/-) | Gibco | 14190-144 | |
DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | |
DuraPrep | 3M | 8635 | |
EBM-2 Medium | Lonza | CC-3156 | Base for both serum free and full growth medium |
EGM-2 SingleQuots | Lonza | CC-3162 | Used with EBM-2 for both serum free and full growth medium |
Electrocautery Tool | Valleylab | SurgII-20 | |
Emery Cloth | 3M | 60-0700-0425-8 | 240 grit |
Euthasol Euthanasia Solution | Virback Animal Health | ANADA #: 200-071 | |
Fentanyl Patch | Actavis | NDC # 67767-120-18 | |
Flunixin | Schering-Plough | NAC #: 10470183 | |
Foley Catheter (16F) | Bard | 730116 | |
HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
Heat Gun | Milwaukee | 8988-20 | |
Heparin | NDC #: 25021 | ||
Histopaque-1077 | Sigma | H8889-500ML | |
Intubation Tube | Mallinckrodt | 86113 | |
Isoflurane | MWI, Meridian | NDC #13985-030 | |
IV Catheter (18G) | Becton-Dickinson | 381547 | |
Ketamine | Fort Dodge | NDC #0856-2013 | |
Level | Swanson | LLA001 | |
Luer-Lock tip cap | CML Supply | 909-001 | |
Marcaine | Hospira | NDC #: 0409-1560-10 | |
Metzenbaum Scissors | Adler | N/A | |
Micro-introducer (5F) | Galt | KIT 002-01 | |
Mosquito Forceps | Adler | N/A | |
Motor | Herbach and Rademan | H1-08 | |
Oxymorphone | Endo Labs | NDC: 63481-624-10 | |
PKH26 Dye Kit | Sigma | PKH26GL-1KT | |
Porcine Serum | Gemini Bio-Products | 100-115 | 2% concentration in full growth medium |
Potts Scissors | Adler | N/A | |
Precise Vista Skin Stapler | 3M | 3998 | |
PVC Tubing | McMaster-Carr/Insultab | 7132K117 | expanded ID 15.88 mm, recovered ID 7.95 mm |
Right Angle Medium Size | Adler | N/A | |
Scalpel Blade (#10-15) | Bard | 373910 | |
Silicone Tubing | McMaster-Carr | 51735K26 | 16.64 mm OD, 9.52 mm ID |
Syringe (5 cc) | Becton-Dickinson (BD) | 309603 | |
Tegaderm | 3M | 90001 | |
Three-way Stopcock | Kendall | 170060 | |
Ti Tube | Tico Titanium | N/A | Specified as ½” OD, .065″ wall, .370″ ID, .1737 lbs/ft |
Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
Trypsin Neutralizing Solution (TNS) | Lonza | CC-5002 | 0.03% |
Vetropolycin | Pharmaderm Animal Health | NAC #: 12920110 | |
Vicryl Suture (3-0) | Ethicon | J808T | |
Water Bath Sonicator | Branson | B200 |