En metod för sådd titan blod-kontakt biomaterial med autologa celler och testning biokompatibilitet beskrivs. Denna metod använder endotelceller progenitorceller och rör titan, seedad inom några minuter av kirurgisk implantering i svin venae cavae. Denna teknik kan anpassas till många andra implanterbara biomedicinska enheter.
Implanterbara hjärt-enheter är tillverkade av konstgjorda material (t.ex. titan (Ti), expanderad polytetrafluoretylen), som utgör en risk för thromboemboli bildas 1,2,3. Vi har utvecklat en metod för att linje insidan av Ti rör med autologt blod som härrör från människa eller svin endotelceller progenitorceller (EPC) 4. Genom att inympa Ti rör som innehåller en sammanhängande lager av svin EPC i underlägsna hålvenen (IVC) av grisar, testade vi den förbättrade biokompatibilitet för cell-seedade yta i protrombotisk miljön av en stor djurmodell och jämfört den med omodifierade rena metallytor 5,6,7 (Figur 1). Denna metod kan användas för att endothelialize enheter inom några minuter efter implantation och testa den antitrombotiska funktion in vivo.
Perifert blod har erhållits från 50 kg Yorkshire svin och mononukleära celler bråkdel odlas för att isolera EPC 4,8. TI rör (9,4 mm ID) var färdigskurna i tre 4,5 cm längsgående sektioner och ihop med krympslang. En sådd enhet byggdes, vilket möjliggör för långsam rotation av Ti rören.
Vi gjorde en laparotomi på grisar och externaliserats tarmen och urinblåsan. Sharp och dissektion användes för att skeletonize de IVC från bifurkation distalt höger njurartären proximalt. Ti rören var då fyllda med fluorescerande-märkta autologa EPC fjädring och roteras 10 RPH x 30 min för att uppnå en enhetlig cell-beläggning 9. Efter administrering av 100 USP / kg heparin, var båda ändarna av IVC och lumbala ven fastklämd. En 4 cm veinotomy utfördes och enheten in och fyllt med fosfatbuffrad saltlösning. Som veinotomy avslutades med en 4-0 Prolene kör suturer och var en klämma bort för att de-luft IVC. I slutet av förfarandet, var fascia approximeras med 0-PDS (polydioxanone suturer) avslutade subkutan utrymme med 2-0 Vicryl och huden häftade stängd.
Efter 3 – 21 dagar, svin avlivas, enheten explanterade en-block och fast. Ti rören var demonteras och insidan avbildade med ett fluorescerande mikroskop.
Vi fann att den nakna metallen Ti rör helt ockluderade medan EPC-seedade rör förblev patent. Vidare kunde vi visa ett sammanhängande lager av EPC på insidan blod-kontakt yta.
Sammanfattningsvis kan vår teknik användas för att endothelialize Ti rör några minuter efter implantation med autolog EPC för att förhindra trombos av apparaten. Vår kirurgisk metod medger provning förbättrad biokompatibilitet sådan modifierad utrustning med minimal blodförlust och EPC-seedade yta störningar.
Metoden för cell-sådd Ti rör som presenteras här gör att läkare och forskare att snabbt och enhetligt endothelialize blod-kontaktytorna implantat. Eftersom vi isolera och expandera EPC från perifert blod prov, är ingen större invasiv förfarande som krävs för att skörda dessa celler. Dessutom EPC är autolog, och därför är risken för att immunreaktion till den cell-seedade implantat elimineras. De principer som visat i hans protokoll kan utnyttjas inte bara för Ti rör, men för många andra biomaterial som används vid hjärt-medicin.
Kritiska steg i detta protokoll är noggrann rengöring av Ti rör, då vi fann att några anhängare film av föroreningar kompromisser cell följsamhet. Dessutom är en långsam rotationshastighet (omvänt proportionell mot rörets diameter) väsentligt under sådd processen, kan så att EPC bosätta långsamt och hålla sig till ytan som Ti röret är i rörelse.
Vår metod för sådd omedelbart före implantationen undviker opraktiskt ex gånger vivo kultur; celler följer individuellt och senare bildar en sammanhängande blad in vivo, undvika att i embolisering som ett ark omedelbart efter återupprättandet av flödet. Våra tidigare studier visar att när EPC har vuxit till ett sammanhängande lager, de gör en extracellulär matrix som de absolut måste, dessutom minimera eventuella sårskorpa av en endothelial ark. Även möjligheten att emboli lossnar inte helt kan uteslutas, verkar det vara mångfacetterat lägre risk än trombos för hela enheten ytan, problemet är att denna behandling är utformad för att förhindra.
Vår strategi för implantering i den låga skjuvning, använder protrombotisk miljö underlägsna vena cava en av de mest betrodda stora djurmodeller för forskning blod kompatibilitet och trombos av enheter 5,6. Observera att alla djurvård och experiment har utförts i enlighet med National Institute of Health riktlinjer för vård och användning av försöksdjur och endast efter godkännande av Duke University Institutional Animal Care och användning kommittén.
För att framgångsrikt utnyttja denna implantation metod för att testa biomaterial och enheter, är det viktigt att tålmodigt skeletonize de IVC segmentet och ligate alla fartyg venös filial i förberedelse för enhet insättning, så att ingen blödning runt enheten har sitt ursprung i ett "falskt lumen. Ett annat viktigt steg är att tillsätta DPBS in i enheten lumen så att cellerna på insidan röret ytan förblir fuktig under stängningen av veinotomy och innan reperfusion inleds. Om enheten inte kan hittas på den plats där den inopererad, kan det ha migrerat "tidigare i IVC. Detta kan förebyggas genom att placera en sutur (4-O Prolene) genom venen väggen och genom en 2 – 3 mm avsnitt av PVC-slangar så att slangen är fast förankrad i sin nuvarande plats. Om forskaren har svårt att hitta fluorescerande pre-märkta celler visas i Figur 8 efter borttagning i en annars patent tub, är det troligt att cellerna har skalats av som en sammanhängande ark. Detta kan förhindras genom mycket försiktig dissektion av det omgivande ven och dis-montering av tre Ti röret avsnitt, efter fastställande av ven tillsammans med röret.
Vår teknik ger proof-of-concept för att förebygga hjärt-enhet trombos via EPC-sådd. Denna teknik kan användas i utvecklingen av "biogena" implantat fodrad med patientens egna endotelceller progenitorceller. Förstudien i vår svin djurmodell ger för första stegen mot översättningen av denna "personlig medicin" i klinisk praxis.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Leica Microsystems för deras värdefulla råd om bildbehandling titan sektioner och Gemini Bio-produkter för att ge Svinserum används i denna studie. Vi vill också tacka NIH för deras stöd genom Grant "Autolog EPC foder för att förbättra biokompatibilitet av cirkulationsrubbningar hjälpa enheter", RC1HL099863-01. Vidare är vi tacksamma för National Science Foundation Graduate Research Fellowship stöd av Alexandra Jantzen. Vi vill också tacka George Snabb, Mike Lowe och Ianthia Parker för att hjälpa till med många aspekter av det kirurgiska ingreppet och hantering av vår forskning djur. Steven Owen har varit ovärderligt när bearbetning många delar av vår sådd enheten och skär titanrör.
Reagent | Company Name | Catalogue Number | Comments |
Acepromazine | Boehringer-Ingelheim | BIC670025 | NAC# 10280002 |
Alconox Powered Precision Cleaner | Alconox | 1104 | |
Balfour Surgical Retractor | Adler | N/A | |
Baytril | Bayer | APVMA 46028/0705 | |
Butterfly Needle (19G) | Terumo | SV19CLK | |
Chlorhexidine | 3M | 9200 | |
Clamps (45-degree) | Aesculap | FC339T | |
DPBS (-/-) | Gibco | 14190-144 | |
DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | |
DuraPrep | 3M | 8635 | |
EBM-2 Medium | Lonza | CC-3156 | Base for both serum free and full growth medium |
EGM-2 SingleQuots | Lonza | CC-3162 | Used with EBM-2 for both serum free and full growth medium |
Electrocautery Tool | Valleylab | SurgII-20 | |
Emery Cloth | 3M | 60-0700-0425-8 | 240 grit |
Euthasol Euthanasia Solution | Virback Animal Health | ANADA #: 200-071 | |
Fentanyl Patch | Actavis | NDC # 67767-120-18 | |
Flunixin | Schering-Plough | NAC #: 10470183 | |
Foley Catheter (16F) | Bard | 730116 | |
HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
Heat Gun | Milwaukee | 8988-20 | |
Heparin | NDC #: 25021 | ||
Histopaque-1077 | Sigma | H8889-500ML | |
Intubation Tube | Mallinckrodt | 86113 | |
Isoflurane | MWI, Meridian | NDC #13985-030 | |
IV Catheter (18G) | Becton-Dickinson | 381547 | |
Ketamine | Fort Dodge | NDC #0856-2013 | |
Level | Swanson | LLA001 | |
Luer-Lock tip cap | CML Supply | 909-001 | |
Marcaine | Hospira | NDC #: 0409-1560-10 | |
Metzenbaum Scissors | Adler | N/A | |
Micro-introducer (5F) | Galt | KIT 002-01 | |
Mosquito Forceps | Adler | N/A | |
Motor | Herbach and Rademan | H1-08 | |
Oxymorphone | Endo Labs | NDC: 63481-624-10 | |
PKH26 Dye Kit | Sigma | PKH26GL-1KT | |
Porcine Serum | Gemini Bio-Products | 100-115 | 2% concentration in full growth medium |
Potts Scissors | Adler | N/A | |
Precise Vista Skin Stapler | 3M | 3998 | |
PVC Tubing | McMaster-Carr/Insultab | 7132K117 | expanded ID 15.88 mm, recovered ID 7.95 mm |
Right Angle Medium Size | Adler | N/A | |
Scalpel Blade (#10-15) | Bard | 373910 | |
Silicone Tubing | McMaster-Carr | 51735K26 | 16.64 mm OD, 9.52 mm ID |
Syringe (5 cc) | Becton-Dickinson (BD) | 309603 | |
Tegaderm | 3M | 90001 | |
Three-way Stopcock | Kendall | 170060 | |
Ti Tube | Tico Titanium | N/A | Specified as ½” OD, .065″ wall, .370″ ID, .1737 lbs/ft |
Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
Trypsin Neutralizing Solution (TNS) | Lonza | CC-5002 | 0.03% |
Vetropolycin | Pharmaderm Animal Health | NAC #: 12920110 | |
Vicryl Suture (3-0) | Ethicon | J808T | |
Water Bath Sonicator | Branson | B200 |