1. הכנת EM רשתות לציפוי פחמן ממלאים כוס זכוכית גדול עם מים מזוקקים. השתמש פיפטה זכוכית לרדת טיפה אחת של הקולודיון (~ 20μl, 2% אצטט amyl, מדעי מיקרוסקופית אלקטרונים, פנסילבניה, ארה"ב) על פני השטח של המים. וממנו יתפשט כדי ליצור שכבת פלסטיק דקה על המים / משטח האוויר; הערה: ירידה הראשון וממנו ניתן להשתמש כדי לנקות את השטח מכל מים חלקיקי אבק. לאחר הסרת הסרט מירידה הראשונה, פני המים ברור של אבק. מקום EM רשתות, 400 או 200 גילדר רשת רשתות Cu שנרכשו טד פלה בע"מ (ארה"ב), אחד אחד על שכבת פלסטיק צף על פני המים, אנחנו בדרך כלל מקום 50 ~ 100 רשתות דפוס ואריזה קרוב, עם נוצצים בצד של הרשת כלפי מטה לתוך שכבת פלסטיק (איור 1A). הערה: 400 רשתות רשת טובים שגרתי רשתות כתם שלילי EM, ואילו 200 רשתות רשת טובים לאיסוף תמונות זוג הטיה. חותכים עוגהce נייר עם ממדים מעט גדול יותר מאשר באזור שבו רשתות מונחות על שכבת פלסטיק. הנח את הנייר בזהירות על גבי הרשת (איור 1B), ולחכות עד הנייר הופך רטוב לחלוטין (איור 1C). הערה: סוגים שונים של נייר יש קליטה שונה תעריפי המים. חשוב כי העיתון לא לספוג מים מהר מדי. לדוגמה, נייר פילטר רגיל לא טוב למטרה זו, משום שהוא סופג מים מהר מדי ועושה הרבה קמטים. הסרט פחמן עשויה מנייר מקומט אינו שטוח, ולכן לא טוב לאיסוף תמונות זוג להטות עבור אקראי שחזור להטות חרוטי 3D. צריך לבדוק בעיתונים שונים כדי למצוא אחד מתאים. במעבדה שלנו, יש לנו כבר משתמש הניירות ופנקסים קנה בחנות מכולת מקומית. לפעמים נייר העיתון נמצא גם להיות מתאים. אפשרות נוספת היא להשתמש בנייר אורז עבה יחסית המשמש קליגרפיה סינית / יפנית. במהירות לעשות חתכים על הסרט פלסטיק סביב וקרובהעיתון ספוג. מיד לאחר מכן, להשתמש זוג מלקחיים כדי להרים את הנייר עם רשתות דחוקה בין הסרט נייר פלסטיק. הנח את הנייר בצלחת פטרי עם רשתות פונה כלפי מעלה לייבוש באוויר (איור 1D); הערה: חשוב לתת הנייר אוויר יבש. ייבוש מהיר מדי יוצר קמטים רבים בעיתון. 2. פחמן רשתות ציפוי מכונת ציפוי פחמן המשמשים במעבדה שלנו היא 208C Cressington גבוהה טורבו אבק פחמן Coater (טד פלה). המערכת שלנו מצוידת בצג עובי הסרט Cressington, אשר מודד את עובי הסרט פחמן מצופה מבוסס על העיקרון כי תדירות נדנוד של גביש קוורץ משתנה על ידי המסה של סרט שהופקדו על פני השטח שלו. עם זאת, פרוטוקול המתואר כאן אינו מחייב לפקח על עובי, שכן הוא לעתים קרובות לא זמין במעבדה מדי. חדד מוט הפחמן באמצעות מחדד (טד פלה) ופחמן מוטות לטעון פחמן ציפוי מ 'achine (איור 2A). שני מוטות, אחד עם קצה חד והשני עם סיום שטוח ממוקמים אחד נגד השני. מריחת גריז על החצי הריק של האזור חלבית של שקופית זכוכית ולמקם אותו לצד רשתות (איור 2 ב). רק כמחצית שטח הקפואה של שקופיות הזכוכית צריך להיות מכוסה גריז ואקום. הערה: שטח עם גריז ואקום לא ישתנה צבע לאחר ציפוי פחמן. הניגוד בין האזורים הסמוכים עם או בלי שומן ואקום מספק הערכה של עובי של פחמן מצופה. הנח את הנייר עם רשתות על הבמה של מכונת ציפוי פחמן. מניחים את השקף זכוכית לצד רשתות (איור 2C). הערה: אפשר גם להעביר תחילה את רשתות מצופה בסרט פלסטיק זכוכית שקופית לפני הציפוי, במקרה רשתות רבות ליפול מן העיתון. משאבת ואקום החדר, ולהמתין עד הוואקום מגיע לרמה של 10 -5 Torr. הערה: ציפוי עם ואקום נמוך לעתים קרובות יוצרת ניצוצות רבים, וכתוצאה מכך רבים חלקיקי פחמן גדוליםאת הרשת. הגדלת זרם לאט מאוד. קצה חד של המוט פחמן יהיה הראשון להיות אדום ואז לבן עולה הנוכחי. אין לצפות את קצה בהירות גבוהה ישירות בעין בלתי מזוינת. עצור הגדלת הנוכחי כאשר הציפוי מתחיל. השקופית זכוכית ישתנה צבע לבן אפור בהיר ואחר כך אפור כהה. החושך של השקופיות וקושרת את עובי הסרט פחמן מצופה להיות. בטל הנוכחי לעצור כאשר עובי הציפוי הרצויה הושגה (איור 2 ד). הערה: 1) לאחר חזר ציפוי תהליכים חמצני, פחמן מצופה מבפנים צנצנת פעמון זכוכית יכול להכהות את צבעו. זה הופך את הסרט פחמן מצופה להופיע עבה יותר ממה שהיא באמת. 2) אחת מוט פחמן חידד ניתן להשתמש לציפוי מספר. חדות של קצה מצטמצם בהדרגה לאחר כל ציפוי. הזרם המרבי מושפע חדות של מוט הפחמן. מוט מחודד טרי עם קוטר קטן יותר דורש יחסית נמוךהנוכחי להתאדות פחמן. מאוחר יותר ציפוי עשויה לדרוש מעט הנוכחי גבוה יותר. Vent תא ואקום להסיר רשתות מצופה לשימוש מאוחר יותר. הערה 1. השיטה מדויקת יותר של שליטה על עובי הפחמן היא באמצעות צג עובי הסרט. לחלופין, ניתן לכייל צבע איכותית נגד עובי מדויק נמדד על ידי המסך. עובי פחמן שימושי טכניקה זו היא בין 3 ל 7 ננומטר. זוהי שיטה פשוטה וקלה להכין כמות גדולה של רשתות פחמן מצופה, בדרך כלל ~ 100 רשתות לכל הכנה. רשתות מכילים שכבת פלסטיק דקה, אשר בדרך כלל אינו משפיע על האיכות של התמונה הצבעונית שלילי. עם זאת, רשתות שהוכנו בשיטה זו אינם מתאימים cryoEM. שכבה זו של פלסטיק ניתן להסיר על ידי השריית רשתות לתוך כלורופורם במשך כמה שעות. 3. הכנת formate uranyl פתרון (0.75%) עבור שליליים כתם EM. פרוטוקול מפורטשתואר לעיל 5 לשקול את 37.5mg של formate uranyl לתוך ספל קטן; הוסף 5 מ"ל מים רותחים ומערבבים במשך 5 דקות בחושך; הוסף 10μl 5M NaOH, להמשיך לערבב במשך 5 דקות; סנן את הפתרון באמצעות מזרק מסנן (Fisherbrand, 13mm מזרק מסנן, 0.2μm, ניילון לא סטריליים, מספר קטלוג 09-720-5), ולאחסן את פתרון סינון בצינור פלקון 8ml מכוסה בנייר אלומיניום; . Uranyl הערה אבקת Formate ניתן לרכוש למדעי מיקרוסקופית אלקטרונים (Hatfield, PA), מס 'קטלוגי 22451. Formate פתרון Uranyl אור רגיש צריך להישמר במרחק של אור ישיר, למשל על ידי כיסוי הצינור פלקון עם רדיד אלומיניום. פתרון מוכן טרי יש צבע צהוב בהיר (איור 3A). פתרון הכתם יכול להיות כל הזמן על הספסל במשך שבוע עד שבועיים לפני שהוא מתחיל מזרז. Formate Uranyl הוא חומצי עם pH ~ 4. הוספת NaOH מגדיל את ה-pH, אך הוספתו מהר מדיאו עודף יכול לגרום הכתם כדי לזרז. בנוסף להפקת לעומת זאת, formate uranyl מתקן גם את מדגם חלבון. בגלל קצב קיבוע מהיר כל כך, ה-pH נמוך בדרך כלל לא משפיע על תצורות החלבון הכללית או היווצרות חלבון מורכב 7. 4. פרוטוקול להכנת שלילי רשת כתם EM. פרוטוקול זה מתואר בפירוט בעבר 5 זוהר פריקה פחמן רשת מצופה, באמצעות PELCO easiGlow GlowDischarge המערכת (טד פלה Inc, ארה"ב). הנוכחי נעשה שימוש הוא 15 mA ורשתות הם זוהר שוחרר עבור הערה 30. שניות. Glow-משוחררים רשתות יש להשתמש מיד לאחר פריקת זוהר. לעתים קרובות אנו משתמשים ברשתות בפחות מ 2 שעות לאחר השחרור זוהר. Two מקום 20μl טיפות של מים מזוקקים ושתי טיפות של תמיסת 25μl formate uranyl על פיסת parafilm (איור 3B). החזק זוהר, שוחרר לרשת באמצעות הפוכה כוח אנטי נימי מלקחיים עם המכוניתבון מצופה צד פונה כלפי מעלה. הערה: יש צורך להשתמש אנטי נימי מלקחיים. אחרת, מדגם נוזלי יהיה נשאב ממנו רשתות בכוח נימי בין מלקחיים. החל מדגם חלבון 2μl לרשת, זוהר משוחררים, ולחכות 30 שניות. הערה: זמן ההמתנה ומשך הפריקה זוהר להשפיע על הריכוז של החלבונים adsorbed ברשת. דגימות מדולל מאוד לדרוש יותר פעמים ספיחה. עם זאת, ספיחה ממושכת עשויה לשנות את ריכוז חיץ מאז אדי מים. כדי להשיג פיזור החלקיקים נאות ברשת דורש קצת ניסוי בגישה שגיאה. כתם את המדגם בעזרת נייר פילטר. לגעת במשטח לרשת כדי טיפת מים ולאחר מכן למחוק את המים עם נייר סינון. חזור עם ירידה של 2 מים. לגעת במשטח רשת לירידה הראשון של כתם בקצרה. כתם את הפתרון הכתם בנייר מסנן. לגעת במשטח רשת לירידה השני של הכתם למשך 20 שניות. כתם off פתרון הכתם בנייר מסנן. יבש את הרשת באמצעות ואקום. הערה: אפשר גם להשאיר רשתות על הספסל או במנדף כימי לייבוש באוויר. היתרון של ואקום יבש הוא שאפשר לראות את רשתות ב EM מיד. חפץ אפשרי שנוצר על ידי ייבוש מהיר הכתם אינה אחידה. 5. הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים המיקרוסקופ משמש הפגנה זו היא T12 Tecnai (פיי החברה) מצויד במצלמת 4K Gatan x CCD 4k. בקצרה לבדוק את היישור של המיקרוסקופ לפני הכנסת מדגם: הערה: יש צורך פעם אחת בלבד לכל EM הפגישה. בשנת מיקרוסקופ מודל, ליד יישור מושלם ניתן לשמור קודם לכן. טוען כזה קובץ יישור צריך לשחזר את יישור מיקרוסקופ למצב כמעט מושלם. טען את רשת ב EM מחזיק את הדגימה להטות יחיד סטנדרטי. הכנס לתוך מחזיק CompuStage של T12. חכו במחזור שאיבה כדי להשלים. הכנס את מחזיק לתוך העמודה. </ Li> פוקוס הדגימה ולקבוע defocus הרצוי, בדרך כלל, 1.5um. הערה: ההתמקדות יכולה להיות מושגת באופן ידני או על ידי התמקדות בשיטת בניגוד מינימום או באמצעות מצלמת CCD ללכוד תמונות לחיות לחיות לחשב ספקטרום פורייה כוח. הקלטת תמונה באמצעות מצלמת CCD; ב תמונות של דגימות שלילי חלבונים מוכתם, החלבונים נראים לעתים קרובות עם ניגודיות לבנה, כלומר צפיפות לבן על רקע כהה. שים לב כי בעוד ריכוזי חלבון באזורים שונים של אותה רשת הם בדרך כלל די דומה, אחד מקיים רמות שונות של כתמים באזורים שונים של הרשת זהה. לפעמים באזורים יכול היה מכתים אחיד או אפילו מכתים חיובי (החלבון מופיע כהה על רקע בהיר), בעוד כמה תחומים אחרים יש כתם מושלמת. זה לעתים קרובות יש צורך לחפש את הרשת כדי לאתר אזור טוב הדמיה. 6. נציג תוצאות דוגמאות של תמונות טובות אופייני שלילי staדגימות עומד לבחינה, הטחול סוס פריטין (איור 4 א), Fab (איור 4B), ה -20 archaeal הפרוטאזום (איור 4C) ו הנוקלאוזום (איור 4D), מוצגים. באיור 1. הכנת רשתות פחמן מצופה עבור שלילי כתם א"מ.) הצבת רשתות EM אחד על אחד דפוס אריזה סגורה על פני השטח של הסרט הקולודיון. ב) הצבת פיסת נייר מעט גדול יותר בשטח של רשתות. ג) המתן עד הנייר נרטב לגמרי. ד) להרים את הנייר יחד עם רשתות לייבוש האוויר. באיור 2. . ציפוי רשתות EM עם פחמן) הגדרת המאייד פחמן: מקום שני מוטות פחמן במנגנון ציפוי, עם מוט אחד (משמאל) חידד עד קצה נקודה. מוט אחרים (מצד ימין) יש משטח שטוח לבוא במגע עם קצה של נקודה אחת ב ההפוך sIDE. ב) מקום כמות קטנה של שומן ואקום בצד אחד של זכוכית שקופית טיפחו. האזור בתוך המסגרת השחורה יש שומן ואקום. ג) הגדרת רשתות לציפוי. שקופיות הזכוכית משמשים כדי להחזיק את נייר העמדה. ראש החץ מצביע את האזור עם שמן ואקום. ד) לאחר הציפוי, הצבעים של השקופית עם גריז ואקום מכוסה אינו משנה את הצבע. לעומת זאת מצביע על עובי של פחמן מצופה. באיור 3. הממחישות את ההליך מכתים שלילי). טרי formate מוכן (משמאל) פתרון uranyl שקוף ללא סימן של משקעים. אחרי 1 ~ 2 שבועות, ולהתחיל לצבור משקעים בתחתית בתחתית של התחתית. ב) מקום שתי טיפות (~ 25μl) של מים מזוקקים ושתי טיפות של תמיסת uranyl formate בפיסת parafilm. השתמש זוג אנטי נימי מלקחיים להחזיק זוהר משוחררים פחמן מצופה רשת EM עם הצד פחמןמעלה. ירידה של המדגם (~ 2μl) ממוקם ברשת. ג) אחרי המתנה של 30 לשנייה, כתם הפתרון עם נייר סינון. ד) תהפכו את הרשת לגעת בצד מדגם של רשת עם טיפת המים הראשונה. חזור על השלב C ו-D כדי להשלים את התהליך של מכתים. איור 4. דוגמאות EM תמונות של דגימות חלבון מוכתם שלילי.) הטחול פריטין סוסים, ב ') שבר מחייב האנטיגן (Fab), ג) ה -20 archaeal הפרוטאזום ו-D) הנוקלאוזום. כל התמונות נרשמו עם הגדלה זהה. סרגל קנה מידה הוא 20nm.