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Bioengineering

Preparação de amostras, Imaging, and Analysis Protocolos para Faca de ponta microscopia de varredura

doi: 10.3791/3248 Published: December 9, 2011

ERRATUM NOTICE

Summary

Todo o processo de preparação de amostras de imagens do cérebro para o seccionamento serial usando o microscópio de varredura Knife Edge, para visualização e análise de dados é descrito. Esta técnica é usada atualmente para adquirir dados cérebro do rato, mas é aplicável a outros órgãos, outras espécies.

Abstract

Grandes avanços no alto rendimento, alta resolução, técnicas de microscopia em 3D permitiram a aquisição de grandes volumes de dados neuroanatômicos na resolução submicrometer. Um dos primeiros instrumentos tais produzir todo o cérebro de dados em escala é o microscópio de varredura Knife Edge (KESM) 7, 5, 9, desenvolvido e hospedado no laboratório dos autores. KESM tem sido usado para seção e cérebros imagem inteira do mouse em resolução submicrometer, revelando os detalhes intrincados das redes neuronais (Golgi) 1, 4, 8, as redes vascular (tinta nanquim) 1, 4 e distribuição das células do corpo (Nissl) 3 . O uso de KESM não se restringe ao mouse nem o cérebro. Conseguimos imaged o cérebro do polvo 6, pulmão do rato, e no cérebro de ratos. Estamos atualmente trabalhando em embriões de peixe zebra inteira. Dados como estes podem contribuir enormemente para a pesquisa conectonomia 10; a microcirculação e pesquisa hemodinâmica; e pesquisar por estereologia providing um. exata chão verdade

Neste artigo, vamos descrever o pipeline, incluindo a preparação de amostras (fixação, coloração, e incorporação), KESM configuração e instalação, de corte e de imagem com o KESM, processamento de imagem, preparação de dados e visualização de dados e análise. A ênfase será sobre a preparação de amostras e visualização / análise de dados obtidos KESM. Esperamos que o protocolo detalhado apresentado neste artigo para ajudar a ampliar o acesso a KESM e aumentar a sua utilização.

Protocol

1. Preparação de amostras: Golgi-Cox

  1. Este protocolo segue de perto o protocolo de Mayerich et al. 7.
  2. O mouse C57BL/6J está profundamente anestesiados com anestesia inalatória com isoflurano e depois decapitado.
  3. O cérebro é removido e colocado em uma solução de fixação Golgi-Cox (1% cromato de potássio, dicromato de potássio 1% e 1% de cloreto de mercúrio em água deionizada).
  4. O cérebro é deixado na solução de Golgi-Cox no escuro, à temperatura ambiente, por 10 a 16 semanas.
  5. Os cérebros são lavados em água deionizada durante a noite no escuro.
  6. O cérebro lavado está imerso em solução a 5% de hidróxido de amónio em água deionizada por 7 a 10 dias no escuro à temperatura ambiente. Desta vez foi uma longa preparação para garantir a infiltração de todo o cérebro, para que o precipitado negro teve a chance de forma completamente no tecido.
  7. O cérebro é lavado novamente em água deionizada à temperatura ambiente durante 4 horas e tgalinha desidratado através de uma série graduada de álcoois etílico: 50% e 70% na geladeira (4 ° C), e 85%, 95% (3 mudanças), e 100% (4-5 mudanças) em temperatura ambiente. O cérebro é deixado em cada solução por 24 horas.
  8. O cérebro desidratado é então colocado em acetona (3 a 4 mudanças, cada um para um dia), seguido por uma mistura de araldite-acetona com araldite-to-acetona proporção de 1:2, 1:1, 2:1, e finalmente em 100% araldite (3 mudanças, cada vez que durante a noite), na geladeira (4 ° C).
  9. Finalmente, o cérebro tratada é incorporado em araldite 100% e aquecido a 60 ° C durante 3 dias (cf. protocolo de incorporação, em Abbott e Sotelo 2).
    Se as amostras são incorporados em LR White então as amostras são transferidas da solução de etanol últimos 100% por três mudanças de LR solução Brancos que estão cada mantido no frigorífico durante a noite, que é um procedimento padrão antes da polimerização. Três mudanças são feitas para garantir a infiltração completa. A amostra é tgalinha transferidos para nova LR Branca que é polimerizado em um recipiente fechado a 60 ° C por 24 horas, que é a quantidade necessária de tempo e temperatura para a polimerização adequada.
  10. Fig. 1 mostra um cérebro Golgi-Cox manchada embutido em Araldite.
  11. O bloco da amostra curada é, então, montado no anel espécime de metal usando epoxy, e os lados do bloco aparadas, conforme necessário (ver fig. 2).

2. Preparação de amostras: Nissl

  1. O mouse está profundamente anestesiados com ketamina e xilazina (1,7 mg de cetamina / xilazina 0,26 mg por cada 20 gramas de peso corporal) por via intraperitoneal e então injetada perfundidos transcardially usando 50 mL de temperatura ambiente tampão fosfato (pH 7,4), seguido por 250 mL de quarto temperatura neutra a 10% tamponado (pH 7,4). e, finalmente, com 3,0 cc de tinta nanquim diluído.
  2. Perfusão de corpo inteiro com solução salina e fixador é necessário para limpar o sangue do sistema cardiovascular e para fixar a ti ssues. Perfusão com tinta nanquim é necessário para encher completamente a vasculatura do sistema cardiovascular.
  3. O cérebro resultante é então desidratado através de uma série de álcoois graduados etílico (25% -100%) e depois incorporados em plástico araldite seguindo o protocolo em 1,8-1,9 acima. Se LR branco é o meio de incorporação, em seguida, o protocolo em 1.10 acima é seguido.

4. Preparação de amostras: Espécies genéricas, órgãos genéricos

  1. Para o caso genérico, a fixação pode ser feito tanto com paraformaldeído% 10% formalina tamponada neutra ou 4.
  2. Para volumes pequenos de tecido, a difusão, em vez de perfusão é recomendada para fixação e coloração. No caso de pequenos organismos ou órgãos, coloração também pode ser feito durante o processo de desidratação.
  3. O protocolo de incorporação é o mesmo que acima, embora os tempos de infiltração de solução pode ser reduzido para órgãos ou organismos que são muito menores do cérebro do rato inteiro.
jove_title "setup> 5. KESM e imagem

  1. Desligue bomba, por sua vez no palco, por sua vez diante das câmeras, ligue iluminador.
  2. Aumentar a faca e objetivo.
  3. Instale o anel de amostra.
  4. Dimensão medida exemplar e criar um arquivo de configuração para a aplicação Stage KESM Controller2.
  5. Iniciar Stage KESM Controller2 e inicializar palco.
  6. Inferior faca / objetiva, por sua vez na bomba.
  7. Foco objetivo e câmera, girando o botão de focalização no trem óptica e ajuste de campo da câmera de vista em relação ao fio da navalha.
  8. Pressione em [Continuar] para iniciar a imagem.
  9. Ver Figs. 3-8. Veja 9, 7 de detalhes técnicos.

6. Processamento de imagem e preparação de dados

  1. Copie o executável KESM Processor Stack para a pasta de dados sob a pasta arquivo de configuração (00000, 00001, etc.)
  2. Execute o processador KESM Stack para remover artefato de iluminação e normalizar a intensidade de fundo em todas asimagens. Repita o procedimento para todas as subpastas de dados.
  3. Prepare telhas multiescala a partir do conjunto de dados e fazer o upload e configurar os arquivos no servidor web KESM Cérebro Atlas.
  4. Ver fig. 9.

7. De visualização de dados e análise

  1. Visualização utilizando o Atlas Cerebral KESM. Ir para http://kesm.cs.tamu.edu e selecione o atlas apropriado.
    1. Navegar como no Google Maps.
    2. Zoom in e out como em mapas do Google.
    3. Para ir a uma profundidade diferente, selecione o quão profundo para ir a cada passo a partir do menu pull-down, e clique em qualquer [+] ou [-] para aumentar ou diminuir a profundidade z.
    4. Ajustar o número de sobreposição usando o menu suspenso.
    5. Ajustar o intervalo de sobreposição usando o menu suspenso.
    6. Ver fig. 11.
  2. Visualização usando MeVisLab.
    1. Lançamento MeVisLab.
    2. Criar um novo projeto.
    3. A seguir, novos módulos podem estar criando por typing no nome do módulo na caixa de comando.
    4. Criar módulo [Compose3Dfrom2DFiles], e vá para a pasta desejada. Entra em seqüência arquivo e clique em [GetFileList]. Verifique se as imagens selecionadas podem caber na memória. Clique em [Create3D] para criar volume.
    5. Criar módulo [SetWorldMatrix], e definir a "escala" em "Elementary transformações" x, y, z para o tamanho apropriado voxel (0,6, 0,7, 1,0 para a objetiva de 10x 0.45NA). Link [Compose3Dfrom2DFiles] para [SetWorldMatrix].
    6. Conjunto de Matrix e transforma em "Composição Matrix" a "Ignore", "Ignorar", "Forward".
    7. Criar módulo [Arithmetic1] e defina o "Function" para "Inverter (Max-Img)".
      Link [SetWorldMatrix] para [Arithmetic1].
    8. Criar módulo [View3D] e ligar [Arithmetic1].
    9. Em View3D, enquanto o botão direito do mouse é pressionado, mova o mouse para ajustar o limite. Você pode cortar as regiões, mudança de orientação (mouse move enquanto o botão esquerdo do mouse é pressionado), iluminação mudança (renderin volume deg ou MIP), ligar / desligar de fundo, etc
    10. Ver fig. 10.

8. Resultados representativos:

Aqui, apresentamos todo o cérebro de dados e detalhes. Figos. 15/12 show inteiro do cérebro India Ink, Golgi, e os dados de Nissl sets 1, 4, 3.

Figura 1
Figura 1. Cérebro de camundongo fixo, manchado, e incorporados

Figura 2
Figura 2. Espécime incorporado cérebro do rato montado no anel de amostra.

Figura 3
Figura 3. Microscópio de varredura The Knife Edge (KESM). Uma foto da KESM é mostrado com seus principais componentes marcados: (1) de montagem faca linha de alta velocidade scan-câmera, (2) objetiva do microscópio (3), diamante e colimador de luz, (4) speCimen tanque (para imagens de imersão em água), (5) três eixos de precisão palco ao ar-rolamento (6), iluminador microscópio de luz branca (7), bomba de água (nas costas) para a remoção do tecido seccionado, (8) servidor PC para controle de estágio e de aquisição de imagem (9), base de granito, e (10) ponte de granito.

Figura 4
Figura 4. Princípios de imagem do KESM. O diretor de operação da KESM é ilustrado. O objetivo ea faca é realizada no local, enquanto a amostra aposta no posicionamento move etapa (seta com linha sólida) na resolução de 20 nm ea velocidade de deslocamento de 1-5, e fica roçando a faca de diamante (5 mm de largura para objetiva de 10X), gerando uma seção fina que flui sobre a faca (seta com linha sólida). Linha-scan de imagens é feito perto da ponta da faca.

Figura 5
Figura 5. Câmera KESM e objetiva controles de foco.

Figura 6
Figura 6. KESM montagem faca e controles.

Figura 7
Figura 7. Foco inicial através da porta de observação.

Figura 8
Figura 8. KESM Controlador de Fase 2 do aplicativo (screenshot).

Figura 9
Figura 9. KESM processador de pilha (screenshot).

Figura 10
Figura 10. MeVisLab aplicação (screenshot).

Figura 11
Figura 11 KESM Cérebro Atlas:. Interface Web (screenshot).

Figura 12
Figura 12. KESM todo o cérebro dados tinta nanquim. Visualizações volume de pilhas de dados KESM são mostradas para o conjunto de dados vascular. (A) Close-up dos dados vascular. Largura ~ 100 um. (Bd) Três vistas padrão de toda a vasculatura cerebral do rato (subsampled de dados de alta resolução). Largura ~ 10mm.

Figura 13
Figura 13. KESM todo o cérebro dados do mouse Golgi.

Figura 14
Figura 14. KESM detalhes Golgi dados.

Figura 15
Figura 15. KESM todo o cérebro dados Nissl. (A) Close-up do Ndados ISSL. ~ Hum 300 3. (Bd) Três vistas padrão do conjunto de dados do mouse cérebro Nissl (subsampled de dados de alta resolução). Seção transversal mostrada para uma visão clara das estruturas internas.

Discussion

O KESM permite um levantamento submicrometer nível de grandes volumes de amostra biológica (~ 1 cm 3). Este tipo de volume é suficiente para manter toda órgãos de animais pequenos, tais como cérebro, pulmões, corações, rins, etc digitalizadas imagens de órgãos como pode fornecer informações quantitativas sem precedentes sobre a organização estrutural destes órgãos, e permitir a modelagem computacional de funcionais diversas aspectos desses órgãos, incluindo circuito e de rede dinâmica, propriedades elétricas, fluida e dinâmica de fluxo de ar, ea dinâmica muscular.

O protocolo de preparação de amostras e análise pós-protocolo detalhado neste artigo são esperados para ajudar grupos de pesquisa de fora para ter acesso mais fácil ao KESM e os dados resultantes. O protocolo de operação KESM ajudará esses pesquisadores externos para apreciar os benefícios e limitações desta modalidade de imagem única.

Disclosures

Todd Huffman é com 3Scan, uma empresa comercial que fabrica e comercializa a tecnologia KESM (EUA patente # 6744572).

Acknowledgments

Este projeto foi financiado pelo NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0905041, # 0079874), o Programa de Tecnologia Avançada do Texas (# ATP-000512-0146-2001, # ATP-000.512-0261-2001), Texas A & M Research Foundation, Departamento de Ciência da Computação e Engenharia da Universidade Texas A & M, e 3Scan. Gostaríamos de agradecer a Bernard Mesa (Micro Star Technologies) para consulta e apoio técnico para a instrumentação KESM. Partes principais do desenho e implementação do KESM foi feito por Bruce H. McCormick, que morreu em 2007.

References

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  2. Abbott, L. C., Sotelo, C. Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices. Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).
  3. Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).
  4. Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).
  5. Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. Ravi Rao, A., Cecchi, G. Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).
  6. Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope. BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).
  7. Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).
  8. Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM. Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).
  9. McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).
  10. Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy
Posted by JoVE Editors on 04/07/2013. Citeable Link.

A correction was made to Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. The Nissl staining protocol was modified from:

2. Specimen preparation: Nissl

  1. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  2. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  3. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
  4. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  5. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  6. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
  7. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  8. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  9. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.

to:

2. Specimen preparation: Nissl

  1. This protocol closely follows the protocol of Mayerich et al.7
  2. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of cold 4% phosphate-buffered paraformaldehyde (pH 7.4).
  3. The mouse is then perfused with 100 mL of a solution of 0.1% thionin dye in deionized water, and the body placed in the refrigerator (4 °C) for 24 hours.
  4. After 24 hours, the brain is removed from the calvaria and placed in a fresh solution of 0.1% thionin and left at 4 °C for 7 days. The lengthy duration of this procedure was to ensure full infiltration of thionin into the en bloc preparation.
  5. The brain is then destained and dehydrated through a graded series of ethanols starting with 50% ethanol and water and increasing to 100% ethanol over a time period of 6 weeks. The ethanol changes from 50% to 70% are stored in the refrigerator (4 °C) and all changes of ethanol above 70% are stored at room temperature.
  6. After three changes of acetone (2-4 days in each solution at room temperature), the brain is then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
Preparação de amostras, Imaging, and Analysis Protocolos para Faca de ponta microscopia de varredura
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Cite this Article

Choe, Y., Mayerich, D., Kwon, J., Miller, D. E., Sung, C., Chung, J. R., Huffman, T., Keyser, J., Abbott, L. C. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (58), e3248, doi:10.3791/3248 (2011).More

Choe, Y., Mayerich, D., Kwon, J., Miller, D. E., Sung, C., Chung, J. R., Huffman, T., Keyser, J., Abbott, L. C. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (58), e3248, doi:10.3791/3248 (2011).

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