1. Preparação de amostras: Golgi-Cox Este protocolo segue de perto o protocolo de Mayerich et al. 7. O mouse C57BL/6J está profundamente anestesiados com anestesia inalatória com isoflurano e depois decapitado. O cérebro é removido e colocado em uma solução de fixação Golgi-Cox (1% cromato de potássio, dicromato de potássio 1% e 1% de cloreto de mercúrio em água deionizada). O cérebro é deixado na solução de Golgi-Cox no escuro, à temperatura ambiente, por 10 a 16 semanas. Os cérebros são lavados em água deionizada durante a noite no escuro. O cérebro lavado está imerso em solução a 5% de hidróxido de amónio em água deionizada por 7 a 10 dias no escuro à temperatura ambiente. Desta vez foi uma longa preparação para garantir a infiltração de todo o cérebro, para que o precipitado negro teve a chance de forma completamente no tecido. O cérebro é lavado novamente em água deionizada à temperatura ambiente durante 4 horas e tgalinha desidratado através de uma série graduada de álcoois etílico: 50% e 70% na geladeira (4 ° C), e 85%, 95% (3 mudanças), e 100% (4-5 mudanças) em temperatura ambiente. O cérebro é deixado em cada solução por 24 horas. O cérebro desidratado é então colocado em acetona (3 a 4 mudanças, cada um para um dia), seguido por uma mistura de araldite-acetona com araldite-to-acetona proporção de 1:2, 1:1, 2:1, e finalmente em 100% araldite (3 mudanças, cada vez que durante a noite), na geladeira (4 ° C). Finalmente, o cérebro tratada é incorporado em araldite 100% e aquecido a 60 ° C durante 3 dias (cf. protocolo de incorporação, em Abbott e Sotelo 2). Se as amostras são incorporados em LR White então as amostras são transferidas da solução de etanol últimos 100% por três mudanças de LR solução Brancos que estão cada mantido no frigorífico durante a noite, que é um procedimento padrão antes da polimerização. Três mudanças são feitas para garantir a infiltração completa. A amostra é tgalinha transferidos para nova LR Branca que é polimerizado em um recipiente fechado a 60 ° C por 24 horas, que é a quantidade necessária de tempo e temperatura para a polimerização adequada. Fig. 1 mostra um cérebro Golgi-Cox manchada embutido em Araldite. O bloco da amostra curada é, então, montado no anel espécime de metal usando epoxy, e os lados do bloco aparadas, conforme necessário (ver fig. 2). 2. Preparação de amostras: Nissl O mouse está profundamente anestesiados com ketamina e xilazina (1,7 mg de cetamina / xilazina 0,26 mg por cada 20 gramas de peso corporal) por via intraperitoneal e então injetada perfundidos transcardially usando 50 mL de temperatura ambiente tampão fosfato (pH 7,4), seguido por 250 mL de quarto temperatura neutra a 10% tamponado (pH 7,4). e, finalmente, com 3,0 cc de tinta nanquim diluído. Perfusão de corpo inteiro com solução salina e fixador é necessário para limpar o sangue do sistema cardiovascular e para fixar a ti ssues. Perfusão com tinta nanquim é necessário para encher completamente a vasculatura do sistema cardiovascular. O cérebro resultante é então desidratado através de uma série de álcoois graduados etílico (25% -100%) e depois incorporados em plástico araldite seguindo o protocolo em 1,8-1,9 acima. Se LR branco é o meio de incorporação, em seguida, o protocolo em 1.10 acima é seguido. 4. Preparação de amostras: Espécies genéricas, órgãos genéricos Para o caso genérico, a fixação pode ser feito tanto com paraformaldeído% 10% formalina tamponada neutra ou 4. Para volumes pequenos de tecido, a difusão, em vez de perfusão é recomendada para fixação e coloração. No caso de pequenos organismos ou órgãos, coloração também pode ser feito durante o processo de desidratação. O protocolo de incorporação é o mesmo que acima, embora os tempos de infiltração de solução pode ser reduzido para órgãos ou organismos que são muito menores do cérebro do rato inteiro. jove_title "setup> 5. KESM e imagem Desligue bomba, por sua vez no palco, por sua vez diante das câmeras, ligue iluminador. Aumentar a faca e objetivo. Instale o anel de amostra. Dimensão medida exemplar e criar um arquivo de configuração para a aplicação Stage KESM Controller2. Iniciar Stage KESM Controller2 e inicializar palco. Inferior faca / objetiva, por sua vez na bomba. Foco objetivo e câmera, girando o botão de focalização no trem óptica e ajuste de campo da câmera de vista em relação ao fio da navalha. Pressione em [Continuar] para iniciar a imagem. Ver Figs. 3-8. Veja 9, 7 de detalhes técnicos. 6. Processamento de imagem e preparação de dados Copie o executável KESM Processor Stack para a pasta de dados sob a pasta arquivo de configuração (00000, 00001, etc.) Execute o processador KESM Stack para remover artefato de iluminação e normalizar a intensidade de fundo em todas asimagens. Repita o procedimento para todas as subpastas de dados. Prepare telhas multiescala a partir do conjunto de dados e fazer o upload e configurar os arquivos no servidor web KESM Cérebro Atlas. Ver fig. 9. 7. De visualização de dados e análise Visualização utilizando o Atlas Cerebral KESM. Ir para http://kesm.cs.tamu.edu e selecione o atlas apropriado. Navegar como no Google Maps. Zoom in e out como em mapas do Google. Para ir a uma profundidade diferente, selecione o quão profundo para ir a cada passo a partir do menu pull-down, e clique em qualquer [+] ou [-] para aumentar ou diminuir a profundidade z. Ajustar o número de sobreposição usando o menu suspenso. Ajustar o intervalo de sobreposição usando o menu suspenso. Ver fig. 11. Visualização usando MeVisLab. Lançamento MeVisLab. Criar um novo projeto. A seguir, novos módulos podem estar criando por typing no nome do módulo na caixa de comando. Criar módulo [Compose3Dfrom2DFiles], e vá para a pasta desejada. Entra em seqüência arquivo e clique em [GetFileList]. Verifique se as imagens selecionadas podem caber na memória. Clique em [Create3D] para criar volume. Criar módulo [SetWorldMatrix], e definir a "escala" em "Elementary transformações" x, y, z para o tamanho apropriado voxel (0,6, 0,7, 1,0 para a objetiva de 10x 0.45NA). Link [Compose3Dfrom2DFiles] para [SetWorldMatrix]. Conjunto de Matrix e transforma em "Composição Matrix" a "Ignore", "Ignorar", "Forward". Criar módulo [Arithmetic1] e defina o "Function" para "Inverter (Max-Img)". Link [SetWorldMatrix] para [Arithmetic1]. Criar módulo [View3D] e ligar [Arithmetic1]. Em View3D, enquanto o botão direito do mouse é pressionado, mova o mouse para ajustar o limite. Você pode cortar as regiões, mudança de orientação (mouse move enquanto o botão esquerdo do mouse é pressionado), iluminação mudança (renderin volume deg ou MIP), ligar / desligar de fundo, etc Ver fig. 10. 8. Resultados representativos: Aqui, apresentamos todo o cérebro de dados e detalhes. Figos. 15/12 show inteiro do cérebro India Ink, Golgi, e os dados de Nissl sets 1, 4, 3. Figura 1. Cérebro de camundongo fixo, manchado, e incorporados Figura 2. Espécime incorporado cérebro do rato montado no anel de amostra. Figura 3. Microscópio de varredura The Knife Edge (KESM). Uma foto da KESM é mostrado com seus principais componentes marcados: (1) de montagem faca linha de alta velocidade scan-câmera, (2) objetiva do microscópio (3), diamante e colimador de luz, (4) speCimen tanque (para imagens de imersão em água), (5) três eixos de precisão palco ao ar-rolamento (6), iluminador microscópio de luz branca (7), bomba de água (nas costas) para a remoção do tecido seccionado, (8) servidor PC para controle de estágio e de aquisição de imagem (9), base de granito, e (10) ponte de granito. Figura 4. Princípios de imagem do KESM. O diretor de operação da KESM é ilustrado. O objetivo ea faca é realizada no local, enquanto a amostra aposta no posicionamento move etapa (seta com linha sólida) na resolução de 20 nm ea velocidade de deslocamento de 1-5, e fica roçando a faca de diamante (5 mm de largura para objetiva de 10X), gerando uma seção fina que flui sobre a faca (seta com linha sólida). Linha-scan de imagens é feito perto da ponta da faca. Figura 5. Câmera KESM e objetiva controles de foco. Figura 6. KESM montagem faca e controles. Figura 7. Foco inicial através da porta de observação. Figura 8. KESM Controlador de Fase 2 do aplicativo (screenshot). Figura 9. KESM processador de pilha (screenshot). Figura 10. MeVisLab aplicação (screenshot). <br/> Figura 11 KESM Cérebro Atlas:. Interface Web (screenshot). Figura 12. KESM todo o cérebro dados tinta nanquim. Visualizações volume de pilhas de dados KESM são mostradas para o conjunto de dados vascular. (A) Close-up dos dados vascular. Largura ~ 100 um. (Bd) Três vistas padrão de toda a vasculatura cerebral do rato (subsampled de dados de alta resolução). Largura ~ 10mm. Figura 13. KESM todo o cérebro dados do mouse Golgi. Figura 14. KESM detalhes Golgi dados. Figura 15. KESM todo o cérebro dados Nissl. (A) Close-up do Ndados ISSL. ~ Hum 300 3. (Bd) Três vistas padrão do conjunto de dados do mouse cérebro Nissl (subsampled de dados de alta resolução). Seção transversal mostrada para uma visão clara das estruturas internas.