Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تحضير العينة ، والتصوير ، وتحليل بروتوكولات لالميكروسكوب الضوئي سكين الحافة

Published: December 9, 2011 doi: 10.3791/3248
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 5
1Department of Computer Science and Engineering, Texas A&M University, 2Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Kettering University, 43Scan, 5Department of Veterinary Integrative Biosciences, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

وصفت عملية التحضير الكامل من عينة المخ لتصوير المسلسل sectioning باستخدام مجهر المسح حد السكين ، لتصور وتحليل البيانات. ويجري حاليا استخدام هذه التقنية للحصول على بيانات مخ الفأر ، ولكنه ينطبق على الأجهزة الأخرى ، وأنواع أخرى.

Abstract

وقد مكنت الاكتشافات الكبيرة في الإنتاجية العالية ، وارتفاع القرار ، وتقنيات الفحص المجهري 3D اقتناء كميات كبيرة من البيانات في القرار submicrometer تشريحي عصبي. واحد من الصكوك الأولى من نوعها تنتج في الدماغ كله على نطاق البيانات هي مجهر مسح السكين الحافة (KESM) 7 ، 5 ، 9 ، المتقدمة واستضافت في مختبر المؤلفين. وقد استخدمت KESM إلى الباب والعقول كلها في صورة الفأر submicrometer القرار ، وكشف عن التفاصيل المعقدة للشبكات العصبية (غولجي) 1 ، 4 ، 8 ، وشبكات الأوعية الدموية (الهند الحبر) 1 و 4 و الخلية توزيع الجسم (نيسل) 3 . ولا يقتصر استخدام الفأرة لKESM ولا الدماغ. لقد نجحنا في تصوير الدماغ الأخطبوط 6 ، الرئة الماوس ، والدماغ الفئران. نحن نعمل حاليا على كامل أجنة أسماك الزرد. ويمكن مثل هذه البيانات تسهم إسهاما كبيرا في البحوث connectomics 10 ؛ لدوران الأوعية الدقيقة والبحوث الدورة الدموية ، والتجسيم للبحث عن طريق ال Øقرع ملف. الدقيق الأرضية الحقيقة

في هذه المقالة ، فإننا سوف تصف خط الأنابيب ، بما في ذلك إعداد العينات (إصلاح ، وتلطيخ ، وتضمينها) ، KESM التكوين والإعداد ، والتصوير sectioning مع KESM ، ومعالجة الصور ، وإعداد البيانات ، والبيانات والتصور والتحليل. وسوف يكون التركيز على إعداد العينات والتصور / تحليل البيانات التي تم الحصول عليها KESM. نتوقع بروتوكول المفصلة التي قدمت في هذه المقالة للمساعدة في توسيع فرص الحصول على KESM وزيادة الاستفادة منه.

Protocol

1. تحضير العينة : غولجي كوكس

  1. هذا البروتوكول تتابع عن كثب بروتوكول Mayerich وآخرون. 7.
  2. الماوس C57BL/6J هو تخدير عميق باستخدام التخدير isoflurane نشوق ومقطوعة الرأس ثم.
  3. تتم إزالة المخ وضعت في حل تثبيت غولجي كوكس (1 كرومات البوتاسيوم ٪ ، ثاني كرومات البوتاسيوم 1 ٪ ، وكلوريد الزئبق 1 ٪ في الماء منزوع الأيونات).
  4. ويترك الدماغ في حل غولجي كوكس في الظلام ، في درجة حرارة الغرفة ، لمدة 10 إلى 16 أسبوعا.
  5. وتشطف في ماء منزوع الأيونات أدمغة بين عشية وضحاها في الظلام.
  6. غير منغمسين في الدماغ تشطف 5 ٪ محلول هيدروكسيد الأمونيوم في الماء منزوع الأيونات لمدة 7 إلى 10 أيام في الظلام في درجة حرارة الغرفة. وكان هذه المرة إعداد مطولة لضمان تسلل الدماغ بأكمله ، بحيث يعجل سوداء كانت لديه فرصة لتشكيل تماما في الأنسجة.
  7. يتم شطف الدماغ مرة أخرى في الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات و t50 ٪ و 70 ٪ في الثلاجة (4 درجات مئوية) ، و 85 ٪ ، 95 ٪ (3 تغييرات) ، و 100 ٪ (4-5 تغييرات) في درجة حرارة الغرفة : المجففة من خلال سلسلة متدرجة من الكحول الإيثيلي الدجاجة. ويترك الدماغ في كل حل لمدة 24 ساعة.
  8. ثم يتم وضع الدماغ المجففة في الاسيتون (3-4 التغييرات ، كل ليوم واحد) ، يليه خليط araldite - الأسيتون مع araldite إلى الأسيتون نسبة 1:2 ، 1:1 ، 2:1 ، وأخيرا في araldite 100 ٪ (3 تغييرات ، في كل مرة بين عشية وضحاها) ، في الثلاجة (4 درجات مئوية).
  9. أخيرا ، تم تضمين المعالجة في الدماغ araldite 100 ٪ وتسخينها إلى 60 درجة مئوية لمدة 3 أيام (راجع بروتوكول التضمين في ابوت وسوتيلو 2).
    إذا هي جزء لا يتجزأ العينات في وايت LR ثم يتم نقل العينات من الحل الأخير الإيثانول بنسبة 100 ٪ خلال ثلاثة تغييرات من حل الابيض LR التي يتم الاحتفاظ بها في كل الثلاجة بين عشية وضحاها ، وهو الإجراء القياسي قبل البلمرة. تتم ثلاثة تغييرات لضمان تسلل الكامل. العينة هو رالدجاجة تحويلها إلى الأبيض LR الطازجة التي يتم بلمرة في حاوية مغلقة عند 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، وهو المبلغ المطلوب من الوقت ودرجة الحرارة لالبلمرة المناسبة.
  10. التين. 1 يظهر الدماغ غولجي كوكس ملطخة مضمن في Araldite.
  11. ثم هي التي شنت كتلة العينة شفي على المعدن الدائري باستخدام عينة الايبوكسي ، وعلى جانبي كتلة قلص عند الضرورة (انظر الشكل 2).

2. تحضير العينة : نيسل

  1. الفأر هو الخدر العميق باستخدام الكيتامين وزيلازين (1.7 ملغ الكيتامين / 0.26 ملغ زيلازين بنسبة 20 جرام من وزن الجسم) ثم حقن intraperitoneally perfused transcardially باستخدام 50 مل من درجة حرارة الغرفة الفوسفات مخزنة المالحة (7.4 درجة الحموضة) ، يليه 250 مل من الغرفة درجة الحرارة 10 ٪ مخزنة محايدة الفورمالين (7.4 درجة الحموضة). وأخيرا مع 3.0 سم مكعب من الحبر الهند مخفف.
  2. كامل الجسم مع نضح المياه المالحة وتثبيتي ضروري لمسح الدم من القلب والأوعية الدموية والنظام لإصلاح منظمة الشفافية الدولية ssues. نضح مع الحبر الهند أمر ضروري لملء تماما لنظام الأوعية الدموية القلبية.
  3. الدماغ الناتجة المجففة ثم من خلال سلسلة من الكحول الإيثيلي متدرج (25 ٪ -100 ٪) وجزءا لا يتجزأ من البلاستيك ثم في araldite بعد بروتوكول 1،8-1،9 في أعلاه. إذا LR الأبيض المتوسط ​​التضمين ثم تبعتها في ذلك البروتوكول و1.10 أعلاه.

4. تحضير العينة : الأنواع عامة وهيئات عامة

  1. لحالة عامة ، يمكن القيام تثبيت إما مع 10 ٪ محايد مخزنة بارافورمالدهيد الفورمالين أو 4 ٪.
  2. أحجام صغيرة للنسيج ، فمن المستحسن نشر بدلا من نضح لتثبيت وتلوين. في حالة الكائنات الحية الصغيرة أو الأجهزة ، يمكن أن يتم تلطيخ أيضا أثناء عملية الجفاف.
  3. بروتوكول التضمين هو نفس أعلاه ، بالرغم من أنه يمكن خفض مرات لتسلل حل للأجهزة أو الكائنات الحية التي هي أصغر بكثير من دماغ الفأر كله.
jove_title "KESM> 5. الإعداد والتصوير

  1. إيقاف المضخة ، بدوره على خشبة المسرح ، بدوره على الكاميرا ، بدوره على منار.
  2. رفع السكين وموضوعية.
  3. تثبيت حلقة العينة.
  4. قياس البعد عينة وإنشاء ملف تكوين لتطبيق المرحلة KESM Controller2.
  5. بدء المرحلة KESM Controller2 وتهيئة المسرح.
  6. انخفاض سكين / الهدف ، تشغيل المضخة.
  7. تركز الهدف والكاميرا ، التي تحول مقبض التركيز على تدريب وضبط الحقل البصري للكاميرا وجهة نظر بالنسبة الى حافة السكين.
  8. اضغط على [الذهاب] لبدء التصوير.
  9. انظر التين. 3-8. انظر 9 ، 7 للحصول على التفاصيل التقنية.

6. معالجة الصور وإعداد البيانات

  1. نسخ المعالج القابل للتنفيذ KESM المكدس في مجلد البيانات ضمن المجلد ملف التكوين (00000 ، 00001 ، الخ).
  2. تشغيل المعالج المكدس KESM لإزالة قطعة أثرية الإضاءة وتطبيع كثافة الخلفية في جميعالصور. أكرر لجميع المجلدات الفرعية البيانات.
  3. إعداد البلاط متعددة النطاقات من مجموعة البيانات وتحميلها وإعداد الملفات في الدماغ خادم الويب KESM أطلس.
  4. انظر الشكل. 9.

7. بيانات التصور والتحليل

  1. التصور باستخدام أطلس الدماغ KESM. انتقل إلى http://kesm.cs.tamu.edu وحدد الأطلس المناسبة.
    1. التنقل كما هو الحال في خرائط جوجل.
    2. التكبير والتصغير كما هو الحال في خرائط جوجل.
    3. للذهاب الى عمق مختلفة ، وتحديد كيفية العميق لتذهب في كل خطوة من القائمة المنسدلة ، ثم انقر على [+] أو بإحدى هاتين العقوبتين -- لزيادة أو نقصان عمق ض [].
    4. ضبط عدد تراكب باستخدام القائمة المنسدلة.
    5. ضبط الفاصل الزمني تراكب باستخدام القائمة المنسدلة.
    6. انظر الشكل. 11.
  2. التصور MeVisLab به.
    1. إطلاق MeVisLab.
    2. إنشاء مشروع جديد.
    3. في ما يلي ، يمكن أن يكون إنشاء وحدات جديدة من قبل تايping في اسم الوحدة النمطية في مربع الأوامر.
    4. إنشاء وحدة نمطية [Compose3Dfrom2DFiles] ، وانتقل إلى المجلد المطلوب. أدخل سلسلة الملف وانقر في [GetFileList]. تأكد من أن الصور التي اخترتها يمكن وضعها في الذاكرة. فوق [Create3D] لإنشاء وحدة التخزين.
    5. إنشاء وحدة نمطية [SetWorldMatrix] ، وتعيين "جدول" تحت عنوان "التحويلات الابتدائية" س ، ص ، ض لحجم فوكسل المناسب (0.6 ، 0.7 ، 1.0 لهدف 0.45NA 10X). الرابط [Compose3Dfrom2DFiles] إلى [SetWorldMatrix].
    6. مجموعة مصفوفة والتحويلات تحت عنوان "تكوين مصفوفة" إلى "تجاهل" ، "تجاهل" ، "إلى الأمام".
    7. إنشاء وحدة نمطية [Arithmetic1] ، وتعيين "الفعل" إلى "عكس (IMG ماكس)".
      الرابط [SetWorldMatrix] إلى [Arithmetic1].
    8. إنشاء وحدة نمطية [View3D] وربط [Arithmetic1].
    9. في View3D ، في حين يتم الضغط على زر الفأرة الأيمن ، قم بتحريك الماوس لضبط العتبة. يمكنك المحاصيل المناطق ، وتغيير التوجه (الماوس تتحرك في حين ضغط زر الماوس الأيسر) ، والإضاءة تغيير (حجم renderinز أو MIP) ، تشغيل / إيقاف الخلفية ، الخ.
    10. انظر الشكل. 10.

8. ممثل النتائج :

هنا ، نقدم كامل الدماغ البيانات والتفاصيل. التين. 12-15 تظهر كلها في الدماغ الهند الحبر ، غولجي والبيانات نيسل مجموعات 1 و 4 و 3.

الشكل 1
الشكل 1. الثابتة ، الملون ، وجزءا لا يتجزأ من مخ الفأر

الشكل 2
الشكل 2. شنت المضمنة عينة مخ ​​الفأر على الحلقة العينة.

الشكل 3
الشكل 3 ، والمسح الضوئي حافة السكين مجهر (KESM). وترد صورة للKESM مع مكوناته الرئيسية ملحوظة : (1) سكين الماس عالية السرعة خط تفحص الكاميرا ، (2) الهدف المجهر ، (3) والتجمع ، وميزاء الخفيفة ، (4) جمعية مهندسي البترولcimen دبابات (التصوير غمر المياه) ، (5) ثلاثة محاور الدقة الجوية الحاملة للمرحلة ، (6) منار مجهر الضوء الأبيض ، (7) مضخة المياه (في الظهر) لإزالة الأنسجة مقطوع ، (8) خادم الكمبيوتر لمراقبة المرحلة والحصول على الصور ، (9) قاعدة من الجرانيت ، و (10) جسر الجرانيت.

الشكل 4
الشكل 4. مبادئ التصوير من KESM. ويتجلى مبدأ تشغيل KESM. الهدف هو عقد والسكين في مكان ، في حين أن العينات الموضوعة على التحركات مرحلة تحديد المواقع (السهم مع خط الصلبة) في قرار من 20 نانومتر وسرعة سفر 1-5 ، ويحصل على كشط ضد السكين الماس (5 ملم واسعة عن الهدف 10X) ، وتوليد مقطع رقيقة تتدفق على سكين (السهم مع خط الصلبة). ويتم فحص الخط والتصوير القريب جدا من طرف السكين.

الشكل 5
الشكل 5. KESM الكاميرا والهدف ضوابط التركيز.

الشكل 6
الشكل 6. KESM التجمع سكين والضوابط.

الرقم 7
الرقم 7. الأولية التي تركز من خلال منفذ المراقبة.

الشكل 8
الرقم 8. KESM المراقب تطبيق المرحلة 2 (الصورة).

الرقم 9
الرقم 9. KESM تطبيق المعالج المكدس (الصورة).

الرقم 10
الرقم 10. MeVisLab التطبيق (الصورة).

الرقم 11
الرقم 11 KESM أطلس الدماغ : واجهة ويب (الصورة).

الرقم 12
الرقم 12. KESM الحبر الهند بأكملها في الدماغ البيانات. وتظهر حجم كدسات أميبا KESM البيانات لمجموعة البيانات الأوعية الدموية. (أ) عن قرب من البيانات الأوعية الدموية. عرض ~ 100 ميكرون. (BD) ثلاثة آراء مستوى الأوعية الدموية في الدماغ كله الماوس (subsampled من بيانات عالية الوضوح). ~ 10MM العرض.

الرقم 13
الرقم 13. KESM كامل البيانات غولجي مخ الفأر.

الرقم 14
الرقم 14. KESM غولجي تفاصيل البيانات.

الرقم 15
الرقم 15. KESM كامل البيانات نيسل الدماغ. (أ) عن قرب من Nissl البيانات. ~ 300 ام 3. (BD) ثلاثة آراء القياسية للمجلس بكامل هيئته دماغ الفأر البيانات نيسل (subsampled من بيانات عالية الوضوح). مقطع عرضي لعرض رؤية واضحة للهياكل الداخلية.

Discussion

وKESM يسمح لمسح submicrometer المستوى من كميات كبيرة من العينات البيولوجية (~ 1 سم 3). اخذت الخ هذا النوع من حجم كاف لعقد كامل الأجهزة الحيوانات الصغيرة ، مثل العقل والرئتين والقلب والكلى ، وصور من هذه الأجهزة يمكن أن توفر معلومات كمية لم يسبق لها مثيل حول التنظيم الهيكلي لهذه الأجهزة ، وتمكن من النمذجة الحاسوبية الفنية المختلفة جوانب من هذه الأجهزة ، بما في ذلك ديناميات الدوائر والشبكة ، والخصائص الكهربائية ، وديناميات السوائل وتدفق الهواء ، وديناميكية العضلات.

ومن المتوقع أن بروتوكول إعداد العينات وبروتوكول ما بعد تحليل مفصل في هذه المقالة لمساعدة المجموعات البحثية خارج لسهولة الوصول إلى KESM والبيانات الناتجة عن ذلك. فإن بروتوكول العملية KESM مساعدة هؤلاء الباحثين الخارجيين لتقدير الفوائد والقيود المفروضة على هذه الطريقة تصوير فريدة من نوعها.

Disclosures

تود هوفمان هو مع 3Scan ، وهي شركة تجارية التي تقوم بتصنيع وتسويق التكنولوجيا KESM (الولايات المتحدة للبراءات 6744572 #).

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NINDS (# 1R01 - NS54252) ، جبهة الخلاص الوطني (# 0905041 ، 0079874 #) ، وبرنامج التكنولوجيا المتقدمة في تكساس (ATP - # 000512-0146 - 2001 ، # ATP - 000512 - 0261 - 2001) ، تكساس A & M مؤسسة أبحاث ، قسم علوم الكمبيوتر والهندسة في جامعة تكساس A & M ، و3Scan. نود أن نشكر برنار ميسا (مايكرو ستار تكنولوجيز) للتشاور والدعم الفني لأجهزة KESM. وقد تم أجزاء كبيرة من تصميم وتنفيذ KESM بواسطة بروس ماك كورميك ، الذي توفي في عام 2007.

References

  1. Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).
  2. Abbott, L. C., Sotelo, C. Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices. Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).
  3. Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).
  4. Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).
  5. Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).
  6. Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope. BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).
  7. Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).
  8. Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM. Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).
  9. McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).
  10. Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 58 ، sectioning البدنية ، sectioning المسلسل ، المجهر الضوئي ، والدماغ والتصوير ، ومشراح

Erratum

Formal Correction: Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy
Posted by JoVE Editors on 04/07/2013. Citeable Link.

A correction was made to Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. The Nissl staining protocol was modified from:

2. Specimen preparation: Nissl

  1. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  2. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  3. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
  4. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  5. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  6. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
  7. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  8. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  9. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.

to:

2. Specimen preparation: Nissl

  1. This protocol closely follows the protocol of Mayerich et al.7
  2. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of cold 4% phosphate-buffered paraformaldehyde (pH 7.4).
  3. The mouse is then perfused with 100 mL of a solution of 0.1% thionin dye in deionized water, and the body placed in the refrigerator (4 °C) for 24 hours.
  4. After 24 hours, the brain is removed from the calvaria and placed in a fresh solution of 0.1% thionin and left at 4 °C for 7 days. The lengthy duration of this procedure was to ensure full infiltration of thionin into the en bloc preparation.
  5. The brain is then destained and dehydrated through a graded series of ethanols starting with 50% ethanol and water and increasing to 100% ethanol over a time period of 6 weeks. The ethanol changes from 50% to 70% are stored in the refrigerator (4 °C) and all changes of ethanol above 70% are stored at room temperature.
  6. After three changes of acetone (2-4 days in each solution at room temperature), the brain is then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
تحضير العينة ، والتصوير ، وتحليل بروتوكولات لالميكروسكوب الضوئي سكين الحافة
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Choe, Y., Mayerich, D., Kwon, J.,… More

Choe, Y., Mayerich, D., Kwon, J., Miller, D. E., Sung, C., Chung, J. R., Huffman, T., Keyser, J., Abbott, L. C. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (58), e3248, doi:10.3791/3248 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter