我们描述的隔离乳鼠心肌细胞,并准备在组织工程中的纤维蛋白凝胶结构的封装的细胞。我们描述了分析后,电刺激和细胞活力,免疫组织化学染色后产生的积极力量的文化时期,包括组织工程化心肌的方法。
培养细胞在一个三维凝胶环境是一个重要的技术发展为组织工程的结构,以及研究各种体外培养条件下细胞的反应。三维环境更紧密地模仿什么细胞在体内观察到的,由于机械和化学刺激的应用在所有尺寸1。三维水凝胶可以从合成的聚合物,如PEG – DA 2 和 PLGA 3或自然产生的蛋白质, 如胶原蛋白4,透明质酸或纤维蛋白6,7。从一种自然产生的凝血蛋白,纤维蛋白,创建的水凝胶,可以聚合,形成一个网格,是身体的自然伤口愈合过程8的一部分。纤维蛋白是细胞降解和潜在的自体9,使其成为一个理想的临时支架用于组织工程。
在这里,我们详细描述了隔离乳鼠心肌细胞进行为期3天的幼鼠和准备在组织工程中的纤维蛋白凝胶结构的封装的细胞。新生儿心肌细胞在心肌组织的形成和工程4体外研究使用一个共同的细胞来源。纤维蛋白胶混合纤维蛋白原酶凝血酶。凝血酶裂解纤维蛋白原fibrinopeptides FPA和FPB,揭示了相互作用的结合位点, 与其他10个单体。这些相互作用导致单体的自组装,形成了水凝胶网状的成纤维。由于这种酶反应的时间可通过改变比例的纤维蛋白原,凝血酶或钙的比例凝血酶的调整,可以注塑模具11,12不同的几何形状结构。此外,我们可以生成所产生的组织保持一致,我们如何限制在13文化凝胶。
心肌细胞培养工程静态条件下两个星期的心肌组织结构后,已经开始改造构造,可以产生 6电起搏条件下的收缩力。作为本协议的一部分,我们还描述分析改造后的文化时期,包括心肌所产生的主动力的功能分析后确定最终的细胞活力电刺激的方法,以及构造(现场死亡的心肌组织的方法法)和免疫组织化学染色检查的收缩(肌球蛋白重链或MHC)和心肌细胞之间的耦合(连接蛋白43或Cx43的)重要的典型蛋白的表达和形态。
乳鼠心肌细胞在纤维蛋白凝胶结果在体外培养的心肌系统模型在一个一致的和可行的的三维封装。纤维蛋白是生物材料的首选,因为当细胞包埋,他们是代谢活跃,并能够压缩,重塑和再造细胞外基质,是符合本机的心脏组织 12 。因为我们允许心肌细胞排列在这种环境下,其功能是心脏肌肉造成较大的收缩力相比,6各向同性组织特征。对于潜在的治疗应用,这是必要的封装内的材料,促进活力和功能的细胞。这里介绍的协议示范创建纤维蛋白网络控制在一个三维微环境的心肌细胞的行为有效率及准确的手段。
一些潜在的问题可能出现在这些结构的建立和文化。一个潜在的问题是维持细胞活力封装之前,这将显著影响构造的功能。应作出努力,通过减少之间的隔离和纤维蛋白凝胶内的细胞封装时间隔离限制细胞死亡。构造应提供媒体隔日一个严格的时间表。此外,重要的是要确保在所有的解决方案,用于同质化。如果纤维蛋白原,凝血酶和细胞的混合物产生异构环境中,细胞的能力,改造的ECM,机械夫妇和合同是潜在的阻碍。同样重要的是为了防止干扰,在工程组织的连续性,以防止注入的构造过程中形成的气泡。缓解这一问题的方法之一是吸引更多的凝胶,比需要构造,使之成为注射器慢慢注入。最后,一旦纤维蛋白基质已成立,并在培养液中24小时,这是必须脱离环模双方的构造,以促进纤维蛋白凝胶细胞为基础的压实。保持在中间的模具构造,有利于气体和营养交换。坚持环模双方还可能破坏所需的细胞对齐。
重要的是要注意在这个协议的euthanization方法,这是一个可以接受的方法,由国家卫生部和美国兽医协会研究院的指引下,自觉斩首。然而,一些机构建议新生大鼠断头的麻醉剂使用。我们选择了有意识的断头,因为它保证最短的时间内切除的心脏组织/细胞缺氧条件下。相对少量的缺氧可导致心肌缺血和潜在的心肌细胞死亡,这可能显著影响本协议的成果。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是支持的国立卫生研究院 – 国家心脏,肺和血液研究所(奖#R00HL093358以六味地黄丸)。
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Sodium chloride | Sigma | S7653 | PBS |
Potassium chloride | Sigma | P9333 | PBS |
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S7907 | PBS |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS |
Glucose | Sigma | G5400 | Isolation |
hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | Isolation |
fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | Isolation |
large scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | Isolation |
micro-scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | Isolation |
scalpel handle | Fine Science Tools | 10008-13 | Isolation |
scalpel blade | Fisher Scientific | 08-918-5A | Isolation |
Absorbent bench underpad | VWR | 56617-014 | Isolation |
sterile drape | Fisher Scientific | GM42526 | Isolation |
autoclave bag | Fisher | 01-812-54 | Isolation |
gauze pad | Fisher Scientific | 13-761-52 | Isolation |
betadine | Purdue Products | 67618-150-01 | Isolation |
sterile gloves | Fisher Scientific | 19-020 | Isolation |
sterile transfer pipette | Fisher Scientific | 9962 | Isolation |
collagenase | Worthington | CLS2 | Isolation |
Teflon rod 1/4 inch diameter | McMaster-Carr | 8546K11 | Mold part |
Teflon tube 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 8547K31 | Mold part |
Silicone O-Ring 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 9396K204 | Mold part |
Teflon tube 1/4 inch ID, 5/16 inch OD | McMaster-Carr | 52355K14 | Mold part |
Kendall monoject syringes 6cc | Fisher Scientific | 05-561-41 | Mold part |
BD syringe 3cc | Fisher Scientific | 309585 | Mold part |
Bovine Fibrinogen | Sigma | F8630 | Construct |
Bovine Thrombin | Sigma | T7513 | Construct |
1 M HEPES | Sigma | H0887 | Construct |
Sodium Chloride | Sigma | S7653 | Construct |
DMEM | Invitrogen | 10569 | Construct |
Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Construct |
Calcium Chloride | Sigma | 383147 | Construct |
0.2 micron filter | Fisher Scientific | SCGVT05RE | Construct |
40 micron cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Construct |
0.45 micron bottle top filter | Corning | 430627 | Construct |
glass pre-filter | Millipore | AP2007500 | Construct |
18G 1 1/2 inch long needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Construct |
21G 1 inch needle | Fisher Scientific | 14-826C | Construct |
construct jars | Fisher Scientific | 2116 | Construct |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | Media |
horse serum | Sigma | H1138 | Media |
Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000 | Media |
aminocaproic acid | Acros Organics | 103305000 | Media |
ascorbic acid | Sigma | A5960 | Media |
insulin | Sigma | I9278 | Media |
Paraformaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Histology |
Optimal cutting temperature (OCT) | Ted Pella | 27050 | Histology |
2-methylbutane | Fisher | 03551-4 | Histology |
Mouse MYH1/2/4/6 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-32732 | Histology |
Rabbit Connexin 43 primary antibody | Cell Signaling Technology | 3512 | Histology |
Dylight 549-conjugated donkey anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-505-151 | Histology |
Dylight 488-conjugated Donke anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-485-152 | Histology |
Live/dead assay | Invitrogen | L-3224 | Analysis |