Summary
우리는 신생아 cardiomyocytes 및 조직 공학을위한 섬유소의 히드로겔 구조의 캡슐에 대한 세포의 준비의 절연을 설명합니다. 우리는 전기 자극 및 세포 생존과 immunohistological 얼룩에 따라 생성되는 활성 강제를 포함하여 문화 시대 이후 조직 공학 myocardium을 분석하는 방법을 설명합니다.
Abstract
입체 히드로겔 환경에서 Culturing 세포는 조직 공학에 대한 구조를 개발뿐만 아니라 체외에서 다양한 문화 조건 하에서 세포 반응을 연구를위한 중요한 기술이다. 입체 환경은 더 밀접하게 세포로 인해 모든 크기 1 기계적 및 화학적 자극의 응용 프로그램에 생체내에서 관찰 무엇 모방한 것이었 지요. 입체 hydrogels는 중 같은 PEG - DA 2와 3 또는 PLGA 등 콜라겐 4, hyaluronic 산성 5 섬유소 6,7와 같은 자연 발생 단백질의 숫자로 합성 고분자로부터 만들 수 있습니다. 섬유소, 자연스럽게 발생 혈액 응고 단백질에서 생성된 Hydrogels는 신체의 자연 상처 치유 8 프로세스의 일부로 메쉬를 형성 중합 수 있습니다. 섬유소는 조직 공학을위한 이상적인 임시 발판 만들기, 셀 분해 및 9 잠재적 autologous입니다.
여기 자세히 삼일 늙은 쥐의 새끼와 조직 공학을위한 섬유소의 히드로겔 구조의 캡슐에 대한 세포의 준비에서 신생아 cardiomyocytes의 절연을 설명합니다. 신생아 myocytes은 심장 조직 형성 및 엔지니어링 4 체외 연구에서 사용되는 일반적인 셀 소스입니다. 섬유소 젤이 효소 트롬빈과 혼합 섬유소에 의해 생성됩니다. 트롬빈은 다른 단량체 10과 상호 작용하는 구속력이 사이트를 공개, 피브리노겐에서 fibrinopeptides FpA 및 FpB을 클리브. 이러한 상호 작용은 단량체가 히드로겔 메쉬를 형성 섬유로 자체 조립 원인. 이 효소 반응의 타이밍이 섬유소로 트롬빈의 비율을 변경하거나, 트롬빈에 칼슘의 비율로 조정할 수 있기 때문에, 하나는 주사 다른 형상 11,12의 번호와 구조를 주형 수 있습니다. 더 나아가 우리 문화 13시 겔을 제한하는 방법으로 인해 조직의 정렬을 생성할 수 있습니다.
culturing 정적 조건에서 두 주 동안 설계 심장 조직 구성 후 심장 세포의 구조를 개조하기 시작하고 전기 서성 거려 조건 6에 따라 수축 힘을 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜의 일환으로, 우리는 기능 심장 근육에 의해 생성된 활성 힘을 분석 최종 세포 생존을 결정하기위한 전기 자극을뿐만 아니라, 방법에 따라 구축 (라이브 죽었을 포함한 문화 시대 이후 myocardium을 설계 조직을 분석하는 방법을 설명합니다 분석)과 수축 (마이 오신 중쇄 또는 MHC)와 myocytes 사이 세포 커플링 (Connexin 43 또는 Cx43)에 대한 중요한 전형적인 단백질의 표현과 형태를 검토 immunohistological 염색법.
Protocol
1. 신생아 cardiomyocyte 절연 - 준비 (일 전)
이 섹션에서 만든 솔루션 : PBS - 포도당 솔루션은 미디어를 중지합니다.
- 페니실린 - 스트렙토 마이신 (100 단위 / ML 각각 100 μg / ML)과 포도당의 1.98 g 250 ML 1X 멸균 인산하는가 식염수 (PBS)를 버퍼 5 ML을 추가하여 PBS - 포도당 솔루션을 준비하고 추가로 솔루션 볼륨 500 ML로 가져 멸균 1X PBS.
- 250ml 멸균 Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM) 25 ML FBS 및 페니실린 - 스트렙토 마이신 5 ML (위의 동일한 농도)을 추가하여 중지 미디어를 준비하고 0.2 미크론 필터를 통해 멸균 필터링하기 전에 멸균 DMEM 500 ML에 볼륨을 가져.
- autoclaving하여 절연을 위해 필요한 수술 도구 소독 : hemostat을 # 5 포셉, 큰 가위, 마이크로 가위와 메스 핸들 (# 4).
2. 신생아 cardiomyocyte 절연 - 준비 (수확 일)
불임을 유지하기 위해 반드시
이 섹션에서 사용되는 솔루션 : PBS - 포도당 용액, Betadine
- 각각의 쓰레기 들어, 두 멸균 100mm 배양 접시를 후드에 배치하고 얼음처럼 차가운 PBS - 포도당의 ~ 10 ML로 입력합니다. 이들은 다음 멸균 문화 후드에 얼음 가득 얼음 양동이에 배치되어야합니다.
- 후드에 Betadine의 30-40 ML과 250 ML의 비커를 놓습니다.
- 37 ° C 물 목욕으로 병, 인감 장소로 50 ML / PBS - 포도당의 쓰레기를 추가합니다.
- 각 사람은 후드 작업 표면에 underpad 흡수 벤치를 배치하고 멸균 드레이프의 중심 작업 영역을 만지지 않도록 조심하는 상단에 살균 드레이프를 넣으시기 바랍니다. 악기를 만지지 않고 멸균 드레이프로 수술기구와 거즈 패드를 덤프. 다시 비 멸균 장갑과 접촉하지 않도록주의하고, 드레이프로 살균 # 20 메스 칼날과 덤프를 엽니다.
- 후드에 불투명 용기, 장소 새끼로 댐과 장소에서 새끼를 타고
- 멸균 장갑을 끼다
- fourths에 거즈를 접어, Betadine의 비커에 hemostat 장소와 클램프.
- 메스 핸들에 메스 칼날을 넣고 따로 설정할 수 있습니다.
3. 신생아 cardiomyocyte 절연 - 심장 해부
이 섹션에서 사용되는 솔루션 : Betadine, PBS - 포도당 용액
- 엄지와 검지 사이에 양어깨 사이로 곤란하게 피부하여 비 지배적인 손으로 강아지를 선택하십시오. 큰 가위를 사용하여 한 컷의 강아지 목을 벨. , 강아지 전달의 뒷면에서 잘라 척추가 완전히 절단되도록해야합니다.
- betadine 젖었 거즈와 면봉이의 새끼를 낳다 가슴. 함께 양어깨 곤란하게하여 강아지를 확보. 가슴을 노출 부분 thoracotomy를 수행합니다. 따라서 scalpular 해부에 대한 갈비뼈 과거 마음을 강제 적용, 압력을 높이십시오.
- 위대한 혈관을 끊어하고 마음을 제거하는 심장 뒤에 메스 칼날을 실행합니다. 얼음에 PBS - 포도당이 들어있는 배양 접시에있는 마음을 놓으십시오.
- 쓰레기의 각 강아지에 대해 1-3 단계를 반복합니다.
4. 신생아 cardiomyocyte 격리 - 격리 myocyte
솔루션이 섹션에서 만든 / 사용 : PBS - 포도당 용액, collagenase 솔루션, 솔루션을 중지
- 마음이 고립되고 나면, 얼음처럼 차가운 PBS 포도당 용액에 rinsing하여 잔류 혈액과 결합 조직을 제거, 얼음처럼 차가운와 신선한 페트리 접시에 오직 심실 조직과 장소를 격리하기 위해 마음의 상단 1 / 3 삭제 이전 준비 PBS 포도당.
- 조심스럽게 마이크로 가위와 집게를 사용하여 ~ 1 입방 mm로 마음을 말하다.
- , 멸균 전송 피펫을 가지고 피펫의 입 직경 ~ 3mm되도록 가위를 사용하여 팁을 잘라. 50 ML 원뿔과 얼음 장소로 솔루션의 조직 조각 모두를 전송할 수있는 피펫을 사용합니다.
- 37 병에 15,000 타입 II collagenase의 새끼의 쓰레기 단위당 (단위 / MG는 많은에 따라 달라집니다)와 장소를 무게 ° C PBS - 포도당 collagenase 솔루션을 만들려면 이전에 준비 기까지 했어요. 별도의 용기에 잘하고 살균 필터를 섞는다. 37 ° C의 물을 욕조에 다시 넣습니다. 뿐만 아니라 37 ° C의 물을 욕조에 중지 솔루션을 넣으십시오.
- 다진 조직이 원심 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 전체 볼륨 ~ 10 ML 때까지 뜨는을 제거합니다. 원심 튜브에 collagenase 솔루션 7 ML을 추가합니다.
- 원뿔 튜브 37 ° C 배양기 또는 오븐 내부 궤도 흔드는에 튜브 랙에에 조직 조각과 collagenase와 함께 넣어. 약 60 rpm으로 궤도에 뿌리를 켜고 문을 닫습니다. 7분위한 타이머를 설정합니다. collagenase BAC을 배치해야합니다그것 보온 물 목욕으로 K.
- 타이머가 터질 때, 후드에 원뿔 다시 와요. 또한 따뜻한 collagenase를 가져올 후드에 솔루션을 중지합니다. 부드럽게 조직 조각에게 그들을 해산시키기 위해 5-7 시간을 적정하다. 적정 후 조각이 바닥 (2-3 분)에 정착하실 수 있습니다. 조직 조각을 빨아하지 조심하는 많은 뜨는의 최대한을 대기음. 그 후 조직 조각 collagenase 솔루션 7 ML을 추가 7 분 동안 뿌리에있는 인큐베이터에 다시 넣습니다.
- 각 나머지 단계에 대한, 부드럽게 조직 조각을하다 10 회 적정하다. 일단 조직 조각, 정착 뜨는을 분산하고 원뿔 별도의 50 ML에 수집합니다. 조직 조각 collagenase 7 ML 추가 7 분 다시 소화. 뜨는 튜브하려면, 소화에서 뜨는 각뿐만 아니라 이후 다른 serological 피펫 그만 솔루션의 10 ML를 추가합니다.
- collagenase의 모든 (총 7 단계)이 사용되었습니다 때까지 반복합니다.
- 최종 소화 단계 후, 신선한 원뿔로 70μm 체 세포를 통해 세포 솔루션 및 필터와 원뿔 가져가라.
- 5 분 100g에 세포를 다운 스핀과 hemocytometer를 사용하여 계산하는 DMEM의 20 ML에 resuspend, 얼음에 세포를 놓으십시오.
- 장소 Trypan 블루 솔루션 (75 μl Trypan 파랑, 125 μl PBS)에 세포를 50 μl가 계산을위한 hemocytometer 10 μl를 삽입하기 전에 잘 섞는다. 죽은 세포가 파란색하는 동안 라이브 세포는 분명 있습니다. 약 80-90%의 가능성과 함께, 강아지 쥐 약 3,000,000 세포를 기대합니다.
5. 주조 섬유소 젤 구조 - 섬유소 젤을 (사전에 잘 수행) 작성을위한 준비
솔루션이 섹션에서 만든 : 피브리노겐 주식 솔루션, 트롬빈 주식 솔루션 Pluronics 솔루션, 심근 만드는 미디어.
- HEPES로 천천히 혼합하여 섬유소 염분 0.9 %에서 20 MM의 HEPES 버퍼에 섬유소의 33 MG / ML 재고 솔루션을 준비 37에서 몇 시간 동안의 염분 버퍼 ° C. 솔루션은 2-8에서 하룻밤 정착 허용 ° C.를 37 ° C.에 대한 해결책을 따뜻하게 이 솔루션은 멸균입니다 연속 필터 일련의를 통해 필터링 : 40 μm의 세포 strainers, 0.45 μm의 병 유리 미리 필터 상단 필터, 0.2 μm의 병 유리 미리 필터 상단 필터. 이 솔루션은 1 ML, 3 ML aliquots에 aliquoted 및 -20 ° C.에 저장됩니다
- 500 μl 250 μl aliquots 및 동결에로 0.2 μm의 필터 나누어지는를 통해 0.9 %의 식염수와 멸균 탈이온수, 살균 필터 2 ML 18 ML에 트롬빈 500 U를 추가하여 트롬빈의 25 U / ML 재고 솔루션을 준비 -80 ° C.
- 탈이온수 700 ML에 Pluronics F - 127의 50g를 용해하여 5 % W / V Pluronics F - 127 솔루션을 준비합니다. 추가 탈이온수와 1L에 솔루션 볼륨을 가져 오십시오. 0.2 μm의 필터와 살균 필터. Pluronics 솔루션은 각각의 사용 후 멸균 필터링하는 경우 교체하기 전에 세 번까지 사용할 수 있습니다.
- 10% 말 혈청, 2% 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 6 DMEM으로 MG / ML - aminocaproic 산을 추가하여 심근 만들 미디어를 준비합니다. 50 μg / 아스코르비 산의 ML 25 μm의 HEPES 2 인슐린 μg / ML은 먹이를 바로 앞에 추가합니다.
- 함께 한 테프론 막대 하나의 독보적인 소매, 사출 목적으로 제거 수준의 두 개의 테플론 와셔, 두 개의 고무 O - 링 (그림 2A 참조) 넣어 심봉 조립. 사용하기 전에 압력솥.
- 금형 및 plungers로 사용 3cc 주사기 케이스의 바깥쪽 부분 6cc 주사기 케이스를 가지고, luer 잠금 만료를 절단하고 (그림 2A 참조) autoclaving하여 준비.
6. 주조 섬유소 젤 구조 - 섬유소의 젤을 만들기위한 준비 (오른쪽 섬유소의 겔 구조를하기 전에)
이 섹션에서 사용되는 솔루션 : Pluronics 솔루션
- 무균 필터 5% Pluronics 사용하기 전에 필터 0.2 μm의와 F - 127 솔루션입니다. 후드에 1 L의 비커에 5% Pluronics 솔루션에 장소 mandrels과 주사기 케이스. 전체 코팅을 보장하기 위해 후드에 2-3시간에 대한 Pluronics 솔루션에 몸을 담글 부분을 둡니다. Pluronics 솔루션 코트 mandrels과 mandrels에 준수의 섬유소 겔을 방지합니다.
- 2~3시간 보육 후, 다시 병에 5% Pluronics 솔루션을 부어 후드의 표면에 멸균 커튼을 장소와 금형을 구성하는 멸균 장갑을 착용하십시오.
- O - 링과 테플론 와셔 사이에 시일을 보장하기 위해 플런저로 3cc 주사기를 사용하여, 6 CC 주사기 케이스로 구축 mandrels를 놓습니다.
7. 주조 섬유소 겔은 사출 성형을 통해 구성
솔루션이 섹션에서 만든 : F 솔루션, T 솔루션, 휴대 솔루션을.
- 섬유소 젤 1 ML (3.3 MG / ML 최종 피브리노겐 농도, 25 U / ML 최종 트롬빈 농도)을하기 위해서, 20 MM의 HEPES 버퍼에의 558 μl에 피브리노겐 주식 112 μl를 추가하여, 원뿔 튜브 F 솔루션을 만들 수 0.9 % 생리 식염수. 별도의 원뿔 관에서 트롬빈 재고 17 μl, 2 N CA의 1.3 μl를 추가하여 T 솔루션을 만들 수 + DMEM의 135 μl에 + 솔루션입니다. 표 1을 참조하십시오.
- 삼분의 일 원뿔 튜브, 구조에서 세포의 농도가 29,400,000 셀 / ML 또는 세포의 원하는 최종 농도 6 배 농도되도록 볼륨에있는 세포를 아래로 회전하고 세포를 resuspending하여 셀 솔루션을 준비
- 당신은 섬유소 겔 구조, 준비 18G 1 ½ 인치 긴 바늘로 1 mL 주사기를 캐스팅하기 위해 준비가되었을 때. 뿐만 아니라 21G 1 인치 바늘 준비했습니다.
- T 솔루션 : : 세포 솔루션 섬유소 솔루션은 F 솔루션의 4시 1분 1초 비율로 만들어집니다. 젤 중 하나 ML하려면, 167 셀 솔루션의 μL, 그리고 마지막으로 T 솔루션의 167 μl를 추가하여 다음 깨끗한 50 ML의 원심 튜브로 F 솔루션의 667 μL를 추가합니다. 거품을 소개하지 않도록주의하고 함께 해결책을 섞어 피펫. 해결책이 혼합되면 반응 시작과 구성의 주입은 즉시 수행하여야한다.
- 18G 바늘로 이전 준비 주사기를 타고 섬유소 솔루션을 그립니다. 바늘에 들어가기에서 거품을 방지하기 위해 주사기를 반대로하면 안됩니다. 21G 18G 바늘로 바늘을 교체합니다. 공기 방울을 강제로 부드럽게 주사기를 누릅니다.
- 테프론 O - 링에있는 홈 다음 마개와 케이스 사이의 금형에 주사기를 삽입하고 금형에 솔루션을 주입. 전체 충전을 확보하기 위해 상단에있는 홈과 금형을 기울이기. 주사기를 제거하고 나머지 금형을 채우기 위해 계속합니다. 충분 겔 솔루션은 동시에 여러 개의 금형을 채우기 위해 만들 수 있습니다. 솔루션이 빠르게 젤 때문에 그러나, 그것은 일반적으로 6 주어진 시간에 주입 구조의 수를 제한하는 것이 좋습니다.
- 37 세 그룹과 보육이나 오븐에 장소 Parafilm의 금형을 두르고 ° C.는 젤은 젤 시간 중합 수 있도록 20 분 동안 금형에 부화 허용합니다.
- 구성마다 심근 건설 매체의 21 ML 각 문화 병 (Nalgene 스트레이트 사이드 병)를 입력합니다. DMEM과 큰 페트리 접시에 구조와 곡괭이를 강제로 플런저로 케이싱 멸균 3 CC의 주사기를 사용하십시오. 다음 샘플 병에 구조를 놓습니다. 각 4온스 병 2를 저장할 수있는 반면 각각의 16온스 병은 최대 6 구조에 저장할 수.
- 단지에 뚜껑을 비할 배양기로 전송할 수 있습니다. 인큐베이터 안에서, 가스 교환 수 있도록 항아리에 뚜껑을 느슨하게.
- 24 시간 후에, 살균 치과 선택을 가지고 (대표 결과 그림 2 참조) 구조의 균일 정렬을 보장하기 위해 반지 금형의 끝부분에있는 흰색 테프론 O - 링 떨어져 구축 추진.
8. 분석 기술 (문화 2 주 후) - 수축 강제 테스트
이 섹션에서 사용되는 솔루션 : DMEM, 심근 구조 미디어.
- 리드가 목욕탕에있는 전극에 전선으로 자극기에서 온에 악어 클립 클램프. 데이터 수집 보드, 펄스 발생기, 그리고 강제 변환기 최대 전력. 힘 변환기는 5g 설정으로 전환하고 제로해야합니다. 힘 변환기에서 데이터를 표시하고 저장하는 사용자 지정 LabView 프로그램을 엽니다. 각 샘플에 대한 데이터 폴더에 새로운 빈 텍스트 파일을 만듭니다.
- 37 ° C 물 목욕으로 DMEM를 삽입하고 구조를 테스트하기 전에 워밍업하는 시간을 허용합니다. 일단 예열, 장소 37 힘 측정 시스템의 매체 목욕 (그림 3A 참조)에 ° C DMEM.
- 부드럽게 핀셋과 테플론 지원에서 만들 반지를 슬라이딩하여 시료 병의 구조를 제거하고 힘을 측정 시스템 매체 욕조에 고정 금속 게시물을 통해 구조를 놓습니다. 핀셋과 구조를 파악하지 마! 오히려 밀어 핀셋을 사용하고는 심봉 지원에서 구축 리프트.
- 변환기 암 동안 구조의 다른 쪽 끝을 놓고 변환기가 0.50V 읽는 때까지 (약 1.0 g 무력이나 긴장의 10 millinewtons), 강화
- 로 기록하기 위해 수축 힘 데이터에 대한 텍스트 파일을 선택합니다.
- 심장 자극기에 (모델 # S88X, 잔디 테크놀로지), 20V (8 V / cm), 6ms 기간, 1 Hz의 속도로 펄스 전압을 설정합니다.
- 버튼을 'ON / OFF 출력 "을 눌러 전기 서성 거려을 시작합니다
- 파형이 될 때까지 정기적으로 녹음을 시작합니다.
- 조심스럽게 힘을 측정 시스템 매체 목욕에서 구조를 제거하고 배지에 다시 넣습니다. 다음 힘 측정 시스템 매체 목욕에서 DMEM를 제거하고 addit을 분석 신선하고 따뜻한 DMEM로 교체ional 샘플.
- 건축 잘라하고 구조의 길이와 너비를 측정할 수 있도록 그것을 풀다
- 생존 능력, 조직학, 또는 서양 얼룩 측정 등 추가 분석 측정에 사용되는 섹션으로 구성 잘라.
9. 분석 기술 (문화 2 주 후) - 생존을위한 라이브 죽은 분석 (Invitrogen 죽은 / 라이브 분석과 함께) 14 :
이 섹션에서 사용되는 솔루션 : EthD - 1 재고 솔루션 calcein AM 재고 PBS 용액
- PBS로 3 배 5 분 세척과 샘플을 씻어.
- 철저한 혼합을 보장하기 위해이 MM 살균 PBS 및 와동의 10 ML에 EthD - 1 재고 솔루션을 20 μl를 추가합니다.
- calcein이 EthD - 1 솔루션 주식 stolution 오전 4시 MM 5 μl를 추가합니다. 다시 혼합 철저히하도록 와동.
- 건축을 충당하기 위해 위의 솔루션의 충분한 볼륨을 추가합니다.
- 부화는 상온에서 30 분 (염료의 photobleaching 방지하기 위해) 있었다.
- 염료를 제거하고 따뜻한 PBS로 바꿉니다. 관찰하고 형광 현미경으로 이미지를 기록합니다. ethidium homodimer - 1 528 nm의 광으로하고 있으며 617 나노미터 빛을 방출하면서 Calcein은 494 nm의 조명에 의해 흥분과 517 nm의 광을 방출합니다. 샘플 결과를 그림 4를 참조하십시오.
10. 분석 기술 (문화 2 주 후) - 중요 myocyte 단백질에 대한 immunohistochemistry :
이 섹션에서 사용되는 솔루션 : PBS, PBS의 4 % paraformadehyde, PBS에서 5 % 당나귀 혈청, PBS, PBS에 0.1 NG / ML Hoechst 33258에 항체.
- PBS로 3 배 5 분 세척과 샘플을 씻어.
- 4 2~3시간을위한 PBS 용액에 4 % paraformaldehyde와 수정 ° C
- PBS로 3 배 5 분 세척과 샘플을 씻어.
- 샘플은 현재 sectioned 및 스테인드 선택의 프로토콜에 따라, 임베디드 수 있습니다. 이 프로토콜의 나머지 부분은 공촛점 현미경과 이미징을위한 전체 구조 얼룩을 다룹니다. 구성에 확산하기 위해 항체를 위해 더 많은 시간이있을 필요로 배양 시간이 sectioned 조직 그 이상됩니다. 또한, 나머지 모든 단계는 실온에서 실시하고 있습니다.
- 세포 세포막을 permeabilize 30 분 샘플에 0.1 % PBS에서 트라이 튼 - X를 추가합니다.
- PBS로 3 배 10 분 세척으로 샘플을 씻어.
- 샘플에 대한 이차 항체의 비 특정 바인딩을 차단 1 ½ 시간에 대한 표본에 PBS에서 5 % 당나귀 혈청을 추가합니다.
- Connexin 43 (1시 50분 희석)와 마이 오신 중쇄 (1:100 희석) 3 시간 동안 샘플로 PBS에 기본 항체를 추가합니다. 두 단백질을 분류하기 위해서는 연속적으로 당신은 기본 항체가 다른 호스트 (즉, 토끼 및 마우스)에서하고 있는지 확인합니다.
- PBS로 3 배 10 분 세척으로 샘플을 씻어.
- 3 시간 동안 PBS에서 해당 찬란 표시된 차 항체를 추가합니다.
- PBS로 3 배 10 분 세척으로 샘플을 씻어
- 그냥 이미징 전에 공촛점 현미경의 샘플은 15 분 동안 0.1 NG / PBS에 ML Hoechst 33258을 추가합니다.
- PBS로 3 배 10 분 세척으로 샘플을 씻어.
- 공촛점 현미경으로 세포 이미징 (예 : 결과에 대한 그림 4 참조)에 의해 MHC와 Cx43의 샘플 표현을 분석합니다.
11. 대표 결과 / 결과 :
cardiomyocyte 섬유소 구조는 우선 금형의 전체 너비 (그림 2B)을 다루고 있습니다. 방울 구조에 존재하지 않는되어야하며 그것은 전체 길이에 걸쳐 균일한 보일 것입니다. culturing 2 주 후, 약 4분의 1 초기 폭 (그림 2C)의로 구축 계약.
그림 3B와 같이 구조가 우리 사용자 정의 수축 힘 장치 (그림 3A)에 전기적으로 진행되면, 트위치 포스 데이터는 생성할 수 있습니다. 파형은 힘을, 수축의 속도와 휴식의 비율을 결정하기 위해 MATLAB (MathWorks)에서 별도로 분석할 수 있습니다. 약 1.3 MN의 트위치 부대는 6 것으로 예상된다.
구조의 셀 생존은 구조에 산소의 확산 제한으로 인해 구조의 깊이에 따라 달라집니다. 구성, 그림 4A의 표면에, 높은 세포 생존이 관찰됩니다. 공촛점 현미경, 그림 4B와 구조의 정렬된 구조는 빨간색으로 표시된 수축을위한 중요 마이 오신 중쇄, MHC에 의한 관찰됩니다. 녹색으로 표시된 Connexin 43, myocytes 사이 세포 커플링 필요합니다.
그림 1 : 캡슐 과정의 개요
그림 2 : 섬유소의 젤을 만들기위한 A) 별도의 결합 금형 부품. 아프로m 왼쪽 오른쪽으로 두 테플론 와셔 두 개의 실리콘 O - 링, 테플론로드, 테플론 튜브, 완료 심봉, 심봉에 대한 외부 케이스와 플런저). B) 외부 케이싱 (일 공)에서 분출 직후 금형에 건설. 문화 13일 다음과 곰팡이에 대한 C) 압축된 구성 (빨간색 화살표).
그림 3 : 기록 트위치 인력에 대한 A) 사용자 정의 수축 힘 측정 시스템. 게시물 힘 변환기는 수축 힘을 측정하여 컴퓨터에 결과를 출력합니다. 와이어 두 개의 탄소 전극을 포함하는 목욕은 어느 보 구조를 전기 자극기에 연결됩니다. 두 게시물은 장소에 구조를 개최. B) 샘플 트위치 포스 파형 데이터는 0.5 Hz에서에서 전기 자극과 함께 생성된.
그림 4 : 구성, 13 일 (스케일 바 = 400 μm의)의 A) 라이브 / 죽은 분석. 녹색 라이브 세포를 나타내고 빨간색은 죽은 세포를 나타냅니다. 마이 오신 중쇄 (적색), Connexin 43 (녹색) 및 Hoescht 핵 얼룩 (파란색) (스케일 바 = 10 μm의)의 B) 공촛점 이미지.
| F 솔루션 | T 솔루션 | 휴대폰 솔루션 | |||
| 피브리노겐 | 112 μl | 트롬빈 | 17 μl | DMEM에 셀 | 170 μl |
| HEPES | 558μl | 칼슘 + + | 1.3 μl | ||
| DMEM | 152 μl | ||||
| 합계 | 670 μl | 합계 | 170 μl | 합계 | 170 μl |
젤 1 ML에 대한 표 1. 섬유소 겔 솔루션, 수량.
참고 : 20 MM의 HEPES에서 피브리노겐 = 33 MG / ML 섬유소 염분 버퍼
HEPES = 20 MM의 HEPES은 염분 버퍼
0.81 % NaCl 용액에 트롬빈 = 25 U / ML 솔루션
칼슘 + + = 2 N의 염화칼슘 용액
Discussion
심근 시스템의 체외 모델에서 일관성 있고 가능한 삼차원의 섬유소 젤 결과에 신생아 쥐 cardiomyocytes의 캡슐. 세포 속은 때, 그들은 metabolically 활성화하고, 압축 개조 및 원시 심장 조직을 12 일치 세포외 매트릭스를 재현 할 수 있기 때문에 섬유소가 선호 biomaterial입니다. 우리가 cardiomyocytes이 환경에 자신을 맞출 수 있기 때문에, 그들의 기능은 등방성 조직 6 비해 큰 수축 강제의 결과로 심장 근육에 더 많은 특징입니다. 잠재적인 치료 어플 리케이션을 위해, 그것은 생존과 기능을 모두 촉진 물질 내에서 세포를 캡슐이 필요합니다. 프로토콜은 3 차원 microenvironment에서 심장 세포의 동작을 제어하는 섬유소 네트워크를 만들기위한 효율적이고 정확한 방법을 보여 여기 소개.
몇 가지 잠재적인 문제는 이러한 구조의 생성과 문화 중에 발생할 수 있습니다. 한 잠재적인 문제는 크게 구조의 기능에 영향을 미칩니다 이전 캡슐화하기 위해 세포 생존 능력을 유지하고 있습니다. 노력은 격리와 섬유소 젤 내의 세포 캡슐 사이의 시간을 줄임으로써 격리 다음과 세포 죽음을 제한하여야한다. 구조는 엄격한 일정에 따라 매일 미디어를 제공하여야한다. 또한, 사용되는 솔루션의 모든 균등을 보장하기 위해 중요합니다. 피브리노겐, 트롬빈과 세포의 혼합물은 이기종 환경을 생성하는 경우, ECM을 리모델링하는 세포의 능력은 기계적 부부와 계약이 잠재적으로 방해합니다. 설계 조직의 연속성에 장애를 방지하기 위해 구성의 주입시 공기 방울의 형성을 방지하는 것도 중요하다. 이 문제를 완화하는 한 가지 방법은 주사기로 구성을 천천히 주입하는 데 필요한 것보다 더 많은 겔을 그릴 수 있습니다. 마지막으로, 한번 섬유소 매트릭스가 설정하고 24 시간 동안 문화 매체되었습니다, 그것은 섬유소 젤의 셀 기반의 압축을 촉진하기 위해 링 몰드의 측면에서 구조를 분리하는 것이 필수적입니다. 금형의 중간에있는 구조를 유지할 수있다는 것은 가스와 영양소 교환을 용이하게합니다. 반지의 금형의 측면에 준수는 원하는 세포 정렬을 방해 수 있습니다.
그 의식이 잘린가 건강 및 미국 수의학 협회의 의학 국립 연구소 모두의 지침에 따라 적절한 방법으로이 프로토콜의 euthanization의 방법으로 사용됩니다하는 것이 중요합니다. 그러나, 일부 기관은 신생아 쥐에 대한 잘린 다음 마취제 사용을 권장합니다. 그것은 excised 심장 조직 / 세포 hypoxic 조건에서 시간의 최소한을 보장하기 때문에 우리는 의식 잘린을 선택했습니다. hypoxia의 비교적 적은 금액은 국소 빈혈과 크게이 프로토콜의 결과에 영향을 미칠 수있는 잠재적 myocyte 죽음을, myocyte 발생할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
국립 심장 폐 혈액 연구소 (수상 # R00HL093358에 LDB) -이 작품은 국립 보건원에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | PBS |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | PBS |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | PBS |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | PBS |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | Isolation |
| hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | Isolation |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | Isolation |
| large scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | Isolation |
| micro-scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | Isolation |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10008-13 | Isolation |
| scalpel blade | Fisher Scientific | 08-918-5A | Isolation |
| Absorbent bench underpad | VWR international | 56617-014 | Isolation |
| sterile drape | Fisher Scientific | GM42526 | Isolation |
| autoclave bag | Fisher Scientific | 01-812-54 | Isolation |
| gauze pad | Fisher Scientific | 13-761-52 | Isolation |
| betadine | Purdue Products L.P. | 67618-150-01 | Isolation |
| sterile gloves | Fisher Scientific | 19-020 | Isolation |
| sterile transfer pipette | Fisher Scientific | 9962 | Isolation |
| collagenase | Worthington Biochemical | CLS2 | Isolation |
| Teflon rod 1/4 inch diameter | McMaster-Carr | 8546K11 | Mold part |
| Teflon tube 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 8547K31 | Mold part |
| Silicone O-Ring 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 9396K204 | Mold part |
| Teflon tube 1/4 inch ID, 5/16 inch OD | McMaster-Carr | 52355K14 | Mold part |
| Kendall monoject syringes 6cc | Fisher Scientific | 05-561-41 | Mold part |
| BD syringe 3cc | Fisher Scientific | 309585 | Mold part |
| Bovine Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630 | Construct |
| Bovine Thrombin | Sigma-Aldrich | T7513 | Construct |
| 1 M HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Construct |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Construct |
| DMEM | Invitrogen | 10569 | Construct |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Construct |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | Construct |
| 0.2 micron filter | Fisher Scientific | SCGVT05RE | Construct |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Construct |
| 0.45 micron bottle top filter | Corning | 430627 | Construct |
| glass pre-filter | EMD Millipore | AP2007500 | Construct |
| 18G 1 1/2 inch long needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Construct |
| 21G 1 inch needle | Fisher Scientific | 14-826C | Construct |
| construct jars | Fisher Scientific | 2116 | Construct |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | Media |
| horse serum | Sigma-Aldrich | H1138 | Media |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000 | Media |
| aminocaproic acid | Acros Organics | 103305000 | Media |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | Media |
| insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | Media |
| Paraformaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Histology |
| Optimal cutting temperature (OCT) | Ted Pella, Inc. | 27050 | Histology |
| 2-methylbutane | Fisher Scientific | 03551-4 | Histology |
| Mouse MYH1/2/4/6 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32732 | Histology |
| Rabbit Connexin 43 primary antibody | Cell Signaling Technology | 3512 | Histology |
| Dylight 549-conjugated donkey anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | Histology |
| Dylight 488-conjugated Donke anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-485-152 | Histology |
| Live/dead assay | Invitrogen | L-3224 | Analysis |
References
- Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. M. Mechanical, biochemical, and extracellular matrix effects on vascular smooth muscle cell phenotype. Journal of applied physiology. 98, 2321-2327 (2005).
- Guarnieri, D. Covalently immobilized RGD gradient on PEG hydrogel scaffold influences cell migration parameters. Acta. 6, 2532-2539 (2010).
- Krebs, Injectable poly(lactic-co-glycolic) acid scaffolds with in situ pore formation for tissue engineering. Acta. 5, 2847-2859 (2009).
- Zimmermann, W. -H. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature. 12, 452-458 (2006).
- Chung, C., Burdick, J. A. Influence of Three-Dimensional Hyaluronic Acid Stem Cell Chondrogenesis. Tissue engineering. 15, (2009).
- Black, L. D. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue engineering. 15, 3099-3108 (2009).
- Syedain, Z. H., Weinberg, J. S., Tranquillo, R. T. Cyclic distension of fibrin-based tissue constructs: evidence of adaptation during growth of engineered connective tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6537-6542 (2008).
- Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical chemistry. , 152-155 (2010).
- Jockenhoevel, S. Fibrin gel - advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 19, 424-430 (2001).
- Ryan, E. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
- Williams, C. Cell sourcing and culture conditions for fibrin-based valve constructs. Tissue engineering. 12, 1489-1502 (2006).
- Grassl, E. D., Oegema, T. R., Tranquillo, R. T. A fibrin-based arterial media equivalent. Journal of biomedical materials research. 66 (Part A. , 550-561 (2003).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. Journal of biomechanical engineering. 119, 137-145 Forthcoming.
- Invitrogen. >LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells. , Invitrogen. (2005).
