Vi erbjuder en kostnadseffektiv och snabb molekylär genotypning protokoll som använder olika specifika PCR-primers som riktar DNA-sekvens skillnader inom kloroplasten trnL-F spacerområdet att skilja mellan sorter av<em> Imperata cylindrica</em> (Cogongrass) som inte kan särskiljas genom morfologi ensam. Dessa sorter är den federalt listan skadliga ogräs, cogongrass och närbesläktade, utbredd dekorativt sort, jag<em>. cylindrica</em> Var.<em> Koenigii</em> (Japanska blodet gräs).
Vild-typ I. cylindrica (cogongrass) är en av de tio värsta invasiva växter i världen, negativt påverkar jordbruks-och naturresurser i 73 olika länder i Afrika, Asien, Europa, Nya Zeeland, Oceanien och Amerika 1-2. Cogongrass bildar snabbt sprider och monodominant står att förflytta en stor variation av inhemska växtarter och i sin tur hotar de inhemska djur som är beroende av de fördrivna inhemska växtarter för foder och skydd. För att lägga till problemet en prydnadsväxt sort [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] är allmänt marknadsförs under namnen Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, och japanska blod gräs (JBG). Denna mångfald är förmodat steril och icke-invasiv och anses vara en önskvärd ornamental för sina rödfärgade blad. Under de rätta förutsättningarna, kan JBG producera livskraftiga utsäde (Carol Holko, 2009 personlig kommunikation) och kan återgå till en grön invasive form som ofta är omöjlig att skilja från cogongrass som det tar på utmärkande egenskaper vildtyp invasiv variation 4 (figur 1). Detta gör identifiering med morfologi en svår uppgift även för välutbildade botanister. Återgång av JBG till en aggressiv gröna fenotyp är inte heller ovanligt. Använda sekvens jämförelser av kodning och variabla regioner i både kärnvapen och kloroplast-DNA, har vi bekräftat att JBG har återgått till den gröna invasiva inom delstaterna Maryland, South Carolina och Missouri. JBG har sålts och planteras i nästan alla stater i kontinentala USA där det inte finns en aktiv cogongrass angrepp. Omfattningen av återgå problem i inte väl förstådd, eftersom återgick växter är dokumenterade och ofta förstörs.
Tillämpningen av denna molekylära protokoll ger en metod för att identifiera JBG återgår och kan hjälpa till att hålla dessa sorter från co förekommande enND hybridiserande eventuellt. Cogongrass är en obligat outcrosser och när korsade med en annan genotyp, kan producera livskraftiga vinden spridda frön som sprider cogongrass över stora avstånd 5-7. JBG har en något annorlunda genotyp än cogongrass och kan vara i stånd att bilda viabla hybrider med cogongrass. Om du vill lägga till problemet är JBG mer kall och skugga toleranta än cogongrass 8-10, och genflöde mellan dessa två sorter kommer förmodligen att generera hybrider som är mer aggressiva, skugga tolerant, och kall hardy än vildtyp cogongrass. Medan vildtyp cogongrass närvarande infests över 490 miljoner hektar världen över, i sydöstra USA är det infests över 500.000 hektar och kan ockuperar större delen av USA som den snabbt sprider sig norrut på grund av dess breda nisch och geografiska potential 3,7,11. Potentialen för en genetisk korsning är ett allvarligt bekymmer för USDA-APHIS Federal skadliga Week Program. För närvarande är det förbjudet att USDA-APHIS JBG i stater where det finns stora cogongrass angrepp (t.ex. Florida, Alabama, Mississippi). Kan dock hindra de två sorterna genom att kombinera visa sig vara mer svårt som cogongrass och JBG utöka sina distributioner. Dessutom är fördelningen av JBG återkomma närvarande okända och utan förmåga att identifiera dessa sorter morfologi, kan vissa cogongrass infestationer vara resultatet av JBG återgår. Olyckligtvis aktuella molekylära metoder för identifiering förlitar sig typiskt på AFLP (Amplifierade fragment length polymorphisms) och DNA-sekvensering, av vilka båda är tidskrävande och kostsamt. Här presenterar vi den första kostnadseffektiva och pålitliga PCR-baserad molekylär genotypning metod för att noggrant skilja mellan cogongrass och JBG återställa.
Den amerikanska plantskola och industri landskap frodas på odla och sälja exotiska och nya växtarter. Detta, i kombination med den växande globaliseringen av handeln, ökar chanserna att en invasiv växtarter kommer att träda, etablera och sprida i USA Förmågan att federalt reglera sådana växter är beroende av information som ofta inte tillgängliga, inklusive möjligheten att bli invasiv , korrekt taxonomi, och genetiska särskiljbarhet från inhemska och vilda taxa. Eftersom vår kunskap om invasiva växter är ofta begränsad, har importerade växter med dolda invasiva egenskaper har frivilligt införts bara att lära sig senare att de invaderar våra jordbruks-och naturresurser. Detta protokoll syftar till att åtgärda sådana problem som är förknippade med I. cylindrica sorter genom att tillhandahålla den första förenklade molekylär metod som exakt kan skilja mellan vildtyp cogongrass och återgick form av dess dekorativa JBG motsvarighet.
jove_content "> För utvecklingen av detta protokoll, var vild typ cogongrass samlas in från naturaliserade populationerna vid dammen Creek skogsbruk enheten i Santa Rosa County i närheten av Jay, FL i juni 2008. anskaffades från en kommersiell plantskola (Bluebird Nursery, Inc JBG ). i juni 2008 samt från en husägare samling i Columbia, återgår MO JBG erhölls från gård Campbell Geologiska museet vid Clemson University, SC i juni 2008,. från University Park i Riverdale, MA i juni 2009, och från gården av en husägare i Columbia, MO 2009 (identifieras av Leland Cseke). var alla plantor kvar i ett växthus ligger vid University of Alabama i Huntsville (Huntsville, AL).Genetisk sekvensering av DNA samlas in från dessa växter inkluderade på djupet jämförelse av 9 oberoende DNA-regioner som vanligtvis används för streckkodsläsare växter 2. I samtliga fall var de sekvenser av JBG en 100% matchning till de av JBG återgå, vilket bidrar till attverifiera att JBG verkligen återgå till en grön, invasiv form. Endast den nukleära ITS och kloroplasttransitpeptidsekvensen trnL-F regioner har skillnader som kan användas för att genetiskt skilja mellan cogongrass och JBG. ITS-regionen har totalt 3 SNP (single nucleotide polymorphisms) mellan cogongrass och JBG, medan trnL-F regionen har 2 SNP och 2 InDels (infogningar och borttagningar). Dessa genetiska skillnader tillåts variation-specifika PCR-primers för att tas fram som kan skilja mellan vildtyp cogongrass och JBG återgår. De mest tillförlitliga resultat har kommit från primrar härledda från plastiden trnL-F-regionen. Således är detta protokoll baserat på sekvensskillnader mellan de trnL-F regioner av kloroplast genomet av cogongrass, JBG och återgick JBG (figur 4).
Bidra till att skapa primers som är mer specifika för de sorterna i fråga och för att bidra till att undvika falska positiva från närbesläktade arter, all kända trnL-F-sekvenser enligt I. cylindrica sorter jämfördes med trnL-F-sekvenser från närstående gräsarter (43 fristående sekvenser från 29 arter, t.ex. Cymbopogon citratus och Sorghastrum incompletum och Coix Lacryma-Jobi, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum och Sorghum halepense). Även om vi granskat olika specifika primersekvenserna i 29 arter av gräs, specificiteten av sorten-specifika primers har inte heltäckande undersökts för dess förmåga att förstärka DNA från de flesta andra gräsarter. Följaktligen bör vävnad användes för DNA-extraktion noggrant identifieras som I. cylindrica före start detta protokoll. Om gräset inte kan identifieras som antingen cogongrass eller JBG, så föreslår vi att sekvensera PCR-produkten att se till att sekvenser är en exakt matchning för att cogongrass eller JBG. För närvarande är den mest exakta metoden för att kontrollera identiteten hos en viss gräs prov att utföra PCR på både tRNL-F och ITS-regionerna, följt av sekvensen kontroll av PCR-produkter och jämförelse av sekvenserna med kända sekvenser från exakt identifieras taxa. DNA kan amplifieras med användning av kontroll-primrar som beskrivs i detta protokoll (till trnL-F-regionen) eller andra primrar som är tillgängliga i andra publikationer 13-15. Sekvensering är mycket mer arbete och kostnader intensiv än att använda vårt förenklat förfarande.
Kvaliteten hos de primers som användes för PCR är kritisk för framgången av förfarandet. Vi har gjort primers för detta förfarande kan erhållas från Oblique Bio, Inc. ( http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). Fördelen med att beställa primers från Oblique Bio är att de lagrar stora mängder portioner av varje primer från identiskt prov serier som de primers vi använde för optimering i vårt laboratorium. Därför primers inte bara samma sekvens, men thej kommer från exakt samma produktionen mycket som användes i detta protokoll. Använda primers från samma parti, kan bidra till att undvika främmande variabler i det förfarande som kan bero på skillnader i kvaliteten på PCR-primers. På samma sätt kommer medan andra Taq-polymeraser bör fungera bra för PCR, kvaliteten på den använda Taq-polymeras har en inverkan på kvaliteten av PCR-resultat. För att möjliggöra bättre samstämmighet i PCR-reagens, har vi optimerat protokollet med reagens från Clontech. Fördel 2-polymeras (Clontech, Mountain View, CA, Cat # 639.201 eller 639.202) är en blandning av en robust, varm-start Taq polymeras och en korrekturläsning enzym som bidrar till att ge hög specificitet och mer exakta förstärkningar.
Eftersom detta protokoll bygger på kloroplast-DNA, som modern ärvs i gräs kan hybridisering händelser mellan cogongrass och JBG genotyper inte fångas med vår molekylär identifiering förfarande. I fall där hypridization är hjulupphcted rekommenderar vi att du använder nukleära regioner som ärvs från båda föräldrarna. Den vanligaste icke-plastid variabel region att tänka på anläggningen genotypning är den nukleära ribosomala ITS regionen 13-15,17. För närvarande gör vi framsteg mot multiplexering förstärkningen av kloroplasten trnL-F region med den nukleära ITS regionen i samma PCR rör. Multiplexering plastid med nukleära DNA-regioner skulle potentiellt kringgå begränsningarna med att använda antingen ensam, men sådana metoder kräver optimering och ytterligare utvärdering för att fastställa genomförbarheten från fall till fall. Användningen av kvantitativ realtids-PCR (qPCR) och nyare teknik, t.ex. Molecular Beacons (fluorescerande primer prober), är också utvärderas som felsäkra och korrekt sätt växt gentypning.
Protokollet som presenteras här ger en snabb och tillförlitlig metod för att särskilja den JBG återgå från den hos vildtyps-cogongrass. Vi uppmuntrar använderrs av detta protokoll för att kontakta oss för att rapportera resultat som härrör från användningen av detta protokoll. Sådan delad information kommer bidra till att ge information om fördelningen av JBG återgår. Detta kommer också att hjälpa tillsynsmyndigheter på USDA fatta välgrundade beslut om åtgärder som kan behöva att kringgå spridning och potential hybridisering av de mycket invasiva cogongrass sorter.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO) och Betty Marose (UMD) för att få hjälp med att få prover . Vi tackar elever Andrew Adrian (UA-Huntsville) och Derek Thacker (UA-Huntsville) för deras hjälp med att testa detta protokoll, och Joseph Herdy för sitt arbete i inspelningen av videon. Detta arbete har finansierats av National Fish and Wildlife Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69104 or 69106 | Any reputable genomic plant DNA kit that yields good quality DNA should work fine for these procedures. |
trnF(GAA)-F | Oblique Bio, Inc. | 3-0578 | Forward positive control primer |
trnL(5′ exon)-C | Oblique Bio, Inc. | 3-0579 | Reverse positive control primer |
trnLF-C-F1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0864 | Forward wild-type cogongrass primer |
trnLF-C-R1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0865 | Reverse wild-type cogongrass primer |
trnLF-R-F2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0866 | Forward JBG and JBG revert primer |
trnLF-R-R2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0867 | Reverse JBG and JBG revert primer |
Advantage UltraPure PCR dNTP Mix | Clontech, Mountain View, CA | 639125 | |
Advantage 2 Polymerase | Clontech, Mountain View, CA | 639201 or 639202 | A good proof-reading, hot-start Taq polymerase |