Vi en omkostningseffektiv og hurtig molekylær genotypebestemmelse protokol, der anvender forskellige specifikke PCR-primere, som er rettet DNA-sekvensforskelle i chloroplasten trnL-F spacerregionen at skelne mellem varianter af<em> Imperata cylindrica</em> (Cogongrass), som ikke kan skelnes ved morfologi alene. Disse sorter omfatter føderalt opført skadelige ukrudt, cogongrass og nært beslægtede, udbredt pynt sort, jeg<em>. cylindrica</em> Var.<em> Koenigii</em> (Japansk blod græs).
Vildtype I. cylindrica (cogongrass) er en af de top ti værste invasive planter i verden, negativ indvirkning landbrugs-og naturressourcer i 73 forskellige lande i hele Afrika, Asien, Europa, New Zealand, Oceanien og Amerika 1-2. Cogongrass danner hastigt breder sig, monodominant står der fortrænger en lang række af indfødte plantearter og igen true de indfødte dyr, der afhænger af de fordrevne indfødte plantearter for foder og husly. Hvis du vil føje til det problem, en ornamental sort [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] er almindeligt markedsføres under navnene Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, og japansk blod græs (JBG). Denne sort er angiveligt steril og noninvasive og betragtes som en ønskelig ornamental for sine rød-farvede blade. Men under de korrekte forhold, kan JBG producere levedygtige frø (Carol Holko, 2009 personlig kommunikation) og kan vende tilbage til en grøn invasive form, ofte ikke kan skelnes fra cogongrass som det tager for de karakteristiske egenskaber vildtype-invasiv række 4 (figur 1). Dette gør identifikation ved hjælp af morfologi en vanskelig opgave, selv for veluddannede plante taksonomer. Tilbagevenden af JBG til en aggressiv grøn fænotype er heller ikke en sjælden begivenhed. Brug sekvens sammenligninger af kodning og variable regioner i både nukleare og kloroplast DNA, har vi bekræftet, at JBG har vendt tilbage til den grønne invasive i staterne Maryland, South Carolina og Missouri. JBG er blevet solgt og plantet i næsten hver eneste stat i det kontinentale USA, hvor der ikke er en aktiv cogongrass angreb. Omfanget af den tilbage problem ikke godt forstået, fordi reverterede planter er udokumenterede og ofte ødelagt.
Anvendelsen af denne molekylære protokol giver en metode til at identificere JBG tilbage og kan hjælpe med at holde disse sorter fra co-forekommende ennd muligvis hybridiserende. Cogongrass er en obligat outcrosser, og når krydset med en anden genotype, kan producere levedygtige vinden spredte frø, der spreder sig cogongrass over store afstande 5-7. JBG har en lidt forskellig genotype end cogongrass og kan være i stand til at danne levedygtige hybrider med cogongrass. Hvis du vil føje til problemet, JBG er mere kold og skygge tolerant end cogongrass 8-10, og gen flow mellem disse to sorter er tilbøjelige til at generere hybrider, som er mere aggressive, skygge tolerant, og koldt hårdfør end vildtype-cogongrass. Mens vildtype cogongrass øjeblikket inficerer mere end 490 millioner hektar i hele verden, i det sydøstlige USA er det inficerer over 500.000 hektar og er i stand til at besætte det meste af USA, da det hurtigt breder sig nordpå på grund af sin brede niche og geografiske potentiale 3,7,11. Potentialet for en genetisk krydsning er et alvorligt problem for USDA-APHIS Federal skadelige ugeprogram. I øjeblikket, USDA-APHIS forbyder JBG i stater whførend der er store cogongrass angreb (f.eks, Florida, Alabama, Mississippi). Men, kan forhindre de to sorter fra kombinere vise vanskeligere cogongrass og JBG udvide deres distributioner. Endvidere er fordelingen af JBG tilbage i øjeblikket ukendt, og uden evnen til at identificere disse sorter ved morfologi, kan nogle cogongrass parasitære være resultatet af JBG vender. Uheldigvis aktuelle molekylære fremgangsmåder til identifikation typisk afhængige AFLP (Amplificerede polymorfier) og DNA-sekventering, som begge er tidskrævende og dyrt. Her præsenterer vi den første cost-effektiv og pålidelig PCR-baseret molekylær genotypebestemmelse metode til præcist at skelne mellem cogongrass og JBG tilbage.
Den amerikanske børnehave og landskab industrier trives med at dyrke og sælge eksotiske og nye plantearter. Dette, kombineret med den stigende globalisering af handelen, øger chancerne for, at en invasive plantearter vil komme ind, etablere, og spredes i USA Evnen til at føderalt regulere sådanne anlæg bygger på oplysninger, der er ofte ikke tilgængelige, herunder potentialet til at blive invasive , korrekt taksonomi og genetiske selvstændighed fra indfødte og naturaliserede taxa. Fordi vores viden om invasive planter er ofte begrænset, er importerede planter med skjulte invasive egenskaber er villigt kun indføres for at lære senere, at de invaderer vores landbrugs-og naturressourcer. Denne protokol har til formål at løse sådanne problemer i forbindelse med I. cylindrica sorter tilvejebringe den første forenklede molekylære fremgangsmåde, der nøjagtigt kan skelne mellem vild-type cogongrass og vendte tilbage form af dens dekorative JBG modstykke.
jove_content "> For udviklingen af denne protokol, blev vildtype cogongrass indsamlet fra naturaliserede populationer på Pond Creek skovbrug enhed i Santa Rosa County nær Jay, FL i juni 2008. JBG blev indkøbt fra en kommerciel planteskole (Bluebird Nursery, Inc .) i juni 2008 samt fra en boligejer samling i Columbia, vender MO JBG blev opnået fra gården af Campbell Geologisk Museum på Clemson University, SC i juni 2008;. fra University Park i Riverdale, MA i juni 2009, og fra forhaven en boligejer i Columbia, MO i 2009 (identificeret ved Leland Cseke). Alle anlæg blev opretholdt i et drivhus er placeret på University of Alabama i Huntsville (Huntsville, AL).Genetisk sekventering af DNA indsamlet fra disse planter omfattede grundige sammenligninger af 9 uafhængige DNA-regioner der almindeligvis anvendes til stregkode planter 2. I alle tilfælde var de sekvenser af JBG en 100% match til de af JBG tilbage, hvilket bidrager tilkontrollere, at JBG rent faktisk vende tilbage til en grøn, invasiv form. Kun nukleare ITS og kloroplast trnL-F regioner forskelle, der kan anvendes til genetisk skelne mellem cogongrass og JBG. ITS-regionen har i alt 3 SNPs (single nucleotide polymorphisms) mellem cogongrass og JBG, mens trnL-F region har 2 SNPs og 2 InDels (indsætninger og sletninger). Disse genetiske forskelle kunne række-specifikke PCR-primere, der udvikles, der kan skelne mellem vild-type cogongrass og JBG vender. De mest pålidelige resultater er kommet fra primere afledt fra plastidet trnL-F region. Således er denne protokol baseret på sekvensen forskellene mellem trnL-F regioner af chloroplast genom cogongrass, JBG og reverterede JBG (figur 4).
For at hjælpe generere primere, der er mere specifikke for de pågældende sorter og for at hjælpe med at undgå falske positiver fra nært beslægtede arter, all kendte trnL-F sekvenser I. cylindrica sorter blev sammenlignet med trnL-F sekvenser fra beslægtede græsarter (43 uafhængige sekvenser fra 29 arter, f.eks Cymbopogon citratus og Sorghastrum incompletum og Coix Lacryma-jobi, Miscanthus sinensis, saccharum officinarum, Sorghum halepense). Skønt vi undersøgte forskellige specifikke primersekvenser tværs 29 arter af græs, specificiteten af de forskellige specifikke primere ikke er blevet omfattende undersøgt for dets evne til at amplificere DNA fra de fleste andre græsarter. Derfor bør væv, der anvendes til DNA-ekstraktion omhyggeligt identificeres som I. cylindrica før du starter denne protokol. Hvis græsset ikke kan identificeres som enten cogongrass eller JBG, så foreslår vi, sekventering af PCR-produktet at sikre, at sekvenser er en eksakt match til cogongrass eller JBG. I øjeblikket er den mest nøjagtige metode til bekræfte identiteten af en given græs prøve er at udføre PCR på både T-rnL-F og regioner, efterfulgt af sekvensen kontrol af PCR-produkter og sammenligning af sekvenserne med kendte sekvenser fra præcist identificerede taxa. DNA kan forstærkes ved hjælp af kontrol primere er beskrevet i denne protokol (for trnL-F-regionen) eller andre primere, der findes i andre publikationer 13-15. Sekventering er langt mere arbejdskraft og omkostninger intensivt, end at bruge vores forenklet procedure.
Kvaliteten af primerne anvendt til PCR er kritisk for succesen af proceduren. Vi har primerne for denne fremgangsmåde fås fra Oblique Bio, Inc. ( http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). Fordelen ved at anordne de primere fra skrå Bio er, at de lagre et stort antal portioner af hver primer fra den samme prøve produktion serier som primerne vi anvendt til optimering i vores laboratorium. Følgelig primere ikke kun har den samme sekvens, men they kommer fra nøjagtig den samme produktion af masse, som blev anvendt i denne protokol. Brug primere fra samme parti, kan bidrage til at undgå uvedkommende variable i den procedure, som kan skyldes forskelle i kvaliteten af PCR-primere. Ligeledes vil mens andre Taq polymeraser skulle virke fint for PCR, kvaliteten af den Taq anvendte polymerase have en indvirkning på kvaliteten af PCR-resultater. For at muliggøre bedre sammenhæng i PCR-reagenser, har vi optimeret protokol under anvendelse af reagenser fra Clontech. Fordelen 2 Polymerase (Ciontech, Mountain View, CA, Cat # 639201 eller 639202) er en blanding af en robust, hot-start Taq polymerase og en korrekturlæsning enzym, der hjælper til at give en høj specificitet og mere præcise amplifikationer.
Fordi denne protokol bygger på kloroplast DNA, som er maternelt nedarvet i græsser, kan hybridisering begivenheder mellem cogongrass og JBG genotyper ikke kan indfanges med vores molekylær identifikation procedure. I tilfælde, hvor hypridization er suspected, anbefaler vi at bruge nukleare områder, der er nedarvet fra begge forældre. Det mest almindeligt anvendte ikke-plastidgenomet variable region til at overveje i anlægget genotypebestemmelse er det nukleare ribosomale regionen 13-15,17. I øjeblikket er vi gør fremskridt i retning af multiplexing forstærkningen af kloroplast trnL-F region med den nukleare ITS-regionen i det samme PCR-rør. Multiplexing plastidtransformation med nukleare DNA-regioner ville potentielt omgå de begrænsninger ved at bruge enten alene, men sådanne metoder kræver optimering og yderligere evaluering for at afgøre muligheden fra sag til sag. Brugen af kvantitativ real-time PCR (qPCR) og nyere teknologier, såsom molekylære beacons (fluorescerende primer prober), er også vurderet som ikke-sikker og præcis plante genotypebestemmelserne metoder.
Protokollen præsenteres her tilvejebringer en hurtig og pålidelig fremgangsmåde til at skelne JBG tilbage fra den for vildtype-cogongrass. Vi opfordrer brugerrs af denne protokol til at kontakte os at rapportere resultater, der stammer fra anvendelsen af denne protokol. Sådanne delte oplysninger vil bidrage til at give oplysninger om fordelingen af JBG tilbage. Dette vil også hjælpe lovgivere på USDA træffe kvalificerede beslutninger om handlinger, der kan være behov for at omgå spredning og potentiale hybridisering af de meget invasive cogongrass sorter.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO), og Betty Marose (UMD) for hjælp til opnåelse af prøver . Vi takker de studerende Andrew Adrian (UA-Huntsville) og Derek Thacker (UA-Huntsville) for deres hjælp med at teste denne protokol, og Joseph Herdy for sit arbejde i optagelserne til videoen. Dette arbejde blev finansieret af National Fish and Wildlife Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69104 or 69106 | Any reputable genomic plant DNA kit that yields good quality DNA should work fine for these procedures. |
trnF(GAA)-F | Oblique Bio, Inc. | 3-0578 | Forward positive control primer |
trnL(5′ exon)-C | Oblique Bio, Inc. | 3-0579 | Reverse positive control primer |
trnLF-C-F1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0864 | Forward wild-type cogongrass primer |
trnLF-C-R1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0865 | Reverse wild-type cogongrass primer |
trnLF-R-F2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0866 | Forward JBG and JBG revert primer |
trnLF-R-R2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0867 | Reverse JBG and JBG revert primer |
Advantage UltraPure PCR dNTP Mix | Clontech, Mountain View, CA | 639125 | |
Advantage 2 Polymerase | Clontech, Mountain View, CA | 639201 or 639202 | A good proof-reading, hot-start Taq polymerase |