Vi tilbyr en kostnadseffektiv og rask molekylær genotyping protokoll som sysselsetter rekke spesifikke PCR primere som mål DNA sekvens forskjeller innenfor kloroplast trnL-F spacer regionen for å skille mellom varianter av<em> Imperata cylindrica</em> (Cogongrass) som ikke kan skilles ved morfologi alene. Disse variantene omfatter føderalt oppført giftige ugress, cogongrass og nært beslektet, utbredt ornamentale variasjon, jeg<em>. cylindrica</em> Var.<em> Koenigii</em> (Japansk blod gress).
Wild-type I. cylindrica (cogongrass) er en av de ti verste invaderende plantene i verden, negativt påvirker landbruks-og naturressurser i 73 forskjellige land over hele Afrika, Asia, Europa, New Zealand, Oseania og Amerika 1-2. Cogongrass danner hurtig spredning, monodominant stands som fortrenger et stort utvalg av innfødte plantearter og i sin tur truer de innfødte dyrene som er avhengige av de fordrevne innfødte planteartene for grovfôr og husly. Å legge til problemet, en ornamental variasjon [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] er viden markedsført under navnene Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron og japansk blod gress (JBG). Dette mangfoldet er putatively sterilt og ikke-invasiv og regnes som en ønskelig ornamentale for sine rød-fargede bladene. Men under de riktige forholdene, kan JBG produsere levedyktig avkom (Carol Holko, 2009 personlig kommunikasjon) og kan gå tilbake til en grønn jegnvasive form som ofte er umulig å skille fra cogongrass som det tar på de karakteristiske kjennetegn ved villtype invasive utvalg 4 (figur 1). Dette gjør identifisering ved hjelp av morfologi en vanskelig oppgave selv for veltrente plante taksonomer. Hjemfall av JBG til en aggressiv grønn fenotype er heller ikke en sjelden foreteelse. Bruke sekvens sammenligninger av koding og variable regioner i både kjernekraft og kloroplast DNA, har vi bekreftet at JBG har hjemfalt til det grønne invasiv innenfor statene Maryland, South Carolina, og Missouri. JBG er solgt og plantet i omtrent hver eneste stat i det kontinentale USA, hvor det ikke er en aktiv cogongrass infestation. Omfanget av den tilbake problem i ikke godt forstått fordi hjemfalt planter er udokumentert og ofte ødelagt.
Anvendelse av denne molekylære protokollen gir en metode for å identifisere JBG går tilbake og kan bidra til å holde disse variantene fra co forekommende ennd muligens hybridizing. Cogongrass er en obligat outcrosser og når krysset med en annen genotype, kan produsere levedyktig vind-dispergert frø som spres over store avstander cogongrass 5-7. JBG har en litt annen genotype enn cogongrass og kan være i stand til å danne levedyktige hybrider med cogongrass. Å legge til problemet, er JBG mer kald og skygge tolerant enn cogongrass 8-10, og genflyt mellom disse to variantene er sannsynlig å generere hybrider som er mer aggressive, skygge tolerant, og kaldt hardfør enn vill-type cogongrass. Mens villtype cogongrass tiden infiserer over 490 millioner hektar verden over, i Sørøst USA den infiserer over 500.000 hektar og er i stand til opptar det meste av USA som den raskt sprer seg nordover på grunn av sin brede nisje og geografisk potensial 3,7,11. Potensialet for en genetisk kryssing er en alvorlig bekymring for USDA-APHIS Federal skadelige Week Program. Foreløpig forbyr USDA-APHIS JBG i stater hvere er det store cogongrass angrep (f.eks Florida, Alabama, Mississippi). Imidlertid kan hindre de to varianter fra kombinere bevise mer vanskelig som cogongrass og JBG utvide sine distribusjoner. Videre er fordelingen av den JBG tilbake foreløpig ukjent, og uten evne til å identifisere disse varianter gjennom morfologi, kan enkelte cogongrass infestations være resultat av JBG går tilbake. Dessverre, dagens molekylære metoder for identifikasjon typisk stole på AFLP (Amplified Fragment Length polymorfismer) og DNA-sekvensering, som begge er tidkrevende og kostbart. Her presenterer vi den første kostnadseffektiv og pålitelig PCR-baserte molekylære genotyping metode for å nøyaktig skille mellom cogongrass og JBG tilbake.
Den amerikanske barnehage og landskap bransjer trives på dyrking og salg eksotiske og romanen plantearter. Dette, kombinert med den økende globaliseringen av handel, øker sjansene for at en invaderende plantearter vil inn, etablere og spre i USA Evnen til føderalt regulere slike planter er avhengig av informasjon som er ofte ikke tilgjengelig, herunder potensialet til å bli invaderende , riktig taksonomi og genetisk distinctness fra innfødte og naturalisert taxa. Fordi vår kunnskap om invasive planter er ofte begrenset, har importerte planter med skjulte invasive egenskaper blitt frivillig innført bare for å lære senere at de invaderer våre landbruks-og naturressurser. Denne protokollen tar sikte på å løse slike problemer forbundet med I. cylindrica sorter ved å gi den første forenklede molekylære metode som kan nøyaktig skille mellom vill-type cogongrass og hjemfalt form av dekorativt JBG motstykke.
jove_content "> For utviklingen av denne protokollen, ble vill-type cogongrass hentet fra naturalisert populasjonen ved dammen Creek Forestry Unit i Santa Rosa County i nærheten Jay, FL i juni 2008. JBG ble anskaffet fra en kommersiell barnehage (Bluebird Nursery, Inc .) i juni 2008 samt fra et hus samling i Columbia, går MO JBG ble hentet fra gårdsplassen til Campbell Geologisk museum ved Clemson University, SC i juni 2008;. fra University Park i Riverdale, MA i juni 2009, og fra front yard av et hus i Columbia, MO i 2009 (identifisert av Leland Cseke). Alle plantene ble opprettholdt i et drivhus som ligger ved University of Alabama i Huntsville (Huntsville, Alabama).Genetisk sekvensering av DNA hentet fra disse plantene inkluderte i dybden sammenligninger av 9 uavhengige DNA regioner som vanligvis brukes til å strekkode planter 2. I alle tilfeller var sekvenser av JBG en 100% match til de av JBG tilbake, og dermed bidra tilverifisere at JBG ikke tilbake faktisk til en grønn, invasiv form. Bare kjernefysisk ITS og kloroplast trnL-F regionene har forskjeller som kan brukes til genetisk skille mellom cogongrass og JBG. ITS regionen har totalt 3 SNPs (single nukleotid polymorfismer) mellom cogongrass og JBG, mens trnL-F-regionen har to SNPs og 2 InDels (innsettinger og slettinger). Disse genetiske forskjellene tillatt rekke spesifikke PCR primere skal utvikles som kan skille mellom vill-type cogongrass og JBG går tilbake. De mest pålitelige resultater har kommet fra primere derivert fra den plastid trnL-F-regionen. Dermed er denne protokoll basert på sekvensen forskjeller mellom trnL-F områder av kloroplast genomet til cogongrass, JBG og hjemfalt JBG (figur 4).
For å hjelpe generere primere som er mer spesifikke for de varianter i spørsmålet og for å unngå falske positiver fra nært beslektede arter, all kjente trnL-F sekvenser av I. cylindrica varianter ble sammenlignet med trnL-F sekvenser fra beslektede grasarter (43 selvstendige sekvenser fra 29 arter, f.eks Cymbopogon citratus og Sorghastrum incompletum og Coix lacryma-Jobi og Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, durra halepense). Selv undersøkte vi forskjellige-spesifikke primer sekvenser over 29 arter av gress, spesifisiteten av sorten-spesifikke primere har ikke blitt grundig undersøkt for sin evne til å forsterke DNA fra de fleste andre grasarter. Derfor bør vev brukes til DNA-ekstraksjon nøye identifisert som I. cylindrica før du starter denne protokollen. Hvis gresset ikke kan bli identifisert som enten cogongrass eller JBG, så vi foreslår sekvensering av PCR produktet å sørge for at sekvenser er en eksakt match til cogongrass eller JBG. Foreløpig er den mest nøyaktige metoden for å bekrefte identiteten til en gitt gress eksemplar til å utføre PCR på både trnL-F og regioner, etterfulgt av sekvens verifisering av PCR produktene og sammenligning av sekvensene til kjente sekvenser fra nøyaktig identifisert taxa. DNA kan forsterkes ved hjelp av kontroll primere beskrevet i denne protokollen (for trnL-F region) eller andre primere som er tilgjengelige i andre publikasjoner 13-15. Sekvensering er mye mer arbeid og kostnader intensiv enn å bruke vårt forenklet prosedyre.
Kvaliteten på primere som brukes for PCR er avgjørende for å lykkes med forsøket. Vi har gjort de primere for denne prosedyren tilgjengelig fra Oblique Bio, Inc. ( http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). Fordelen til bestilling av primere fra Oblique Bio er at de lagrer store mengder alikvoter av hver primer fra identiske prøven produksjonsserier som primere vi brukte for optimalisering i vårt laboratorium. Følgelig primere ikke bare ha den samme sekvensen, men thei kommer fra nøyaktig samme produksjonen mye som ble brukt i denne protokollen. Bruke primere fra samme tomt, kan bidra til å unngå utenforliggende variabler i prosedyren som kan resultere fra forskjeller i kvaliteten på PCR primere. Likeledes vil mens andre Taq polymerase bør fungere fint for PCR, kvaliteten på Taq polymerase som brukes har en innvirkning på kvaliteten på PCR-resultater. For å muliggjøre bedre konsistens i PCR reagenser, har vi optimalisert protokollen ved hjelp av reagenser fra Clontech. Fordelen 2 Polymerase (Clontech, Mountain View, CA, Cat # 639201 eller 639202) er en blanding av en robust, hot-start Taq polymerase og en korrekturlesing enzym som bidrar til å gi høy spesifisitet og mer nøyaktige presiseringer.
Fordi denne protokollen er avhengig av kloroplast DNA, som er moderlig arvet i gress, kan hybridisering hendelser mellom cogongrass og JBG genotyper ikke fanges med vår molekylær identifikasjon prosedyre. I tilfeller der hypridization er suspected, anbefaler vi å bruke kjernefysiske regioner som er arvet fra begge foreldre. Den mest brukte ikke-plastid variabel region å vurdere i plante genotyping er den kjernefysiske ribosomalt ITS-regionen 13-15,17. Vi er for tiden gjør fremskritt mot multipleksing forsterkningen av kloroplast trnL-F region med at kjernefamiliens ITS-regionen i samme PCR rør. Multipleksing plastid med kjernefysiske DNA regioner ville potensielt omgå begrensningene ved bruk av enten alene, men slike metoder krever optimalisering og ytterligere evaluering for å avgjøre gjennomførbarheten fra sak til sak. Bruk av kvantitative real-time PCR (qPCR) og nyere teknologier, slik som molekylære fyrtårn (fluorescerende primer sonder), vurderes også som fail-safe og nøyaktig plante genotyping metoder.
Protokollen presenteres her gir en rask og pålitelig måte å skille JBG tilbake fra den i vill-type cogongrass. Vi oppfordrer brukerrs av denne protokollen til å kontakte oss for å rapportere resultatene fra bruken av denne protokollen. Slike delte informasjon vil bidra til å gi informasjon om fordelingen av JBG går tilbake. Dette vil også bidra regulatorer ved USDA å ta informerte beslutninger om tiltak som kan være behov for å omgå spredning og potensialet hybridisering av de svært invasive cogongrass varianter.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO), og Betty Marose (UMD) for bistand til innhenting av prøver . Vi takker studentene Andrew Adrian (UA-Huntsville) og Derek Thacker (UA-Huntsville) for deres assistanse i å teste denne protokollen, og Joseph Herdy for sitt arbeid i filmingen av videoen. Dette arbeidet ble finansiert av National Fish and Wildlife Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69104 or 69106 | Any reputable genomic plant DNA kit that yields good quality DNA should work fine for these procedures. |
trnF(GAA)-F | Oblique Bio, Inc. | 3-0578 | Forward positive control primer |
trnL(5′ exon)-C | Oblique Bio, Inc. | 3-0579 | Reverse positive control primer |
trnLF-C-F1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0864 | Forward wild-type cogongrass primer |
trnLF-C-R1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0865 | Reverse wild-type cogongrass primer |
trnLF-R-F2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0866 | Forward JBG and JBG revert primer |
trnLF-R-R2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0867 | Reverse JBG and JBG revert primer |
Advantage UltraPure PCR dNTP Mix | Clontech, Mountain View, CA | 639125 | |
Advantage 2 Polymerase | Clontech, Mountain View, CA | 639201 or 639202 | A good proof-reading, hot-start Taq polymerase |