Anrikning av NK-celler från mänskligt blod med RosetteSep Kit från StemCell Technologies
Summary
Naturliga mördarceller är en liten population av lymfocyter. Här visar vi hur du kan isolera dessa celler från mänskligt blod med negativt urval, med hjälp av ett kit från StemCell Technologies. De erhållna celler är livskraftig och orört av antikroppar, och därför redo att användas för ett antal rutiner.
Abstract
Naturliga mördarceller (NK) celler är stora granulat cytotoxiska lymfocyter som tillhör det medfödda immunförsvaret och spelar stora roller i kampen mot cancer och infektioner, men är också inblandade i ett tidigt skede av graviditeten och transplantatavstötning. Dessa celler finns i perifert blod, från vilken de kan isoleras. Celler kan isoleras med hjälp av antingen positivt eller negativt urval. För positiva val som vi använder antikroppar riktade till en yta markör närvarande endast på celler av intresse medan negativt urval använder vi cocktails av antikroppar riktade till ytan markörer som finns på alla celler men cellerna av intresse. Den senare tekniken ger fördelen av att lämna celler av intresse fria från antikroppar, vilket minskar risken för oönskad cellens aktivering eller differentiering. I denna video-protokoll visar vi hur man skiljer NK-celler från humant blod med negativt urval, med hjälp av RosetteSep kit från StemCell teknik. Förfarandet innebär att få humant perifert blod (under en granskningsnämnder-godkända protokoll för att skydda de mänskliga subjekt) och blanda det med en cocktail av antikroppar som binder till markörer saknas på NK-celler, men finns på alla andra mononukleära celler som finns i perifera blod (t ex T-lymfocyter, monocyter …). Antikropparna som finns i cocktail är konjugerade med antikroppar riktade till glycophorin A på erytrocyter. Alla oönskade celler och röda blodkroppar kommer därför att fastna i komplex. Blandningen av blod och antikroppar cocktail är utspätt, overlayed på en Histopaque lutning och centrifugeras. NK-celler (> 80% ren) kan hämtas i gränssnittet mellan Histopaque och den utspädda plasma. Liknande drinkar finns för anrikning av andra cellpopulationer, såsom mänskliga T-lymfocyter.
Protocol
Discussion
De celler som isolerats med denna teknik kan ytterligare delas in i olika populationer med andra kit cellseparation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Rosette Sep cocktail for human NK cells | Reagent | StemCell Technologies | 15065 | |
| PBS, steile, 1x | Reagent | Gibco / Invitrogen | 14040-058 | |
| Fetal calf serum (FCS, FBS) | Reagent | Gibco / Invitrogen | 16140-071 | |
| Histopaque-1077 | Reagent | Sigma | 10771 |
