Vi beskriver en metode for generering forvandlet B-cellelinjer med Epstein-Barr virus. Vi illustrerer også en roman analyse som kan identifisere B-celler bestemt til å gjennomgå transformasjon så tidlig som tre dager etter smitte.
Infeksjon av B-celler med Epstein-Barr virus (EBV) fører til spredning og påfølgende immortalization, som resulterer i etablering av lymfoblastoid cellelinjer (LCL) in vitro. Siden LCL er latent infisert med EBV, gir de en modell for å undersøke EBV ventetid og virus-drevet B-celleproliferasjon og tumorigenesis 1. LCL har blitt brukt til å presentere antigener i en rekke immunologiske analyser 2, 3. I tillegg kan LCL brukes til å generere humant monoklonalt antistoff 4, 5 og gi et potensielt ubegrenset kilde når tilgang til primære biologiske materialer er begrenset 6, 7.
En rekke metoder har blitt beskrevet å generere LCL. Tidligere metoder har omfattet bruk av mitogens som phytohemagglutinin, lipopolysakkarid 8 og pokeweed mitogen 9 for å øke effektiviteten av EBV-mediert immortalization. Mer nylig har andre brukt immunosuppressive midler som ciklosporin A hemmer T celle-mediert drap av infiserte B-celler 7, 10-12.
Den betydelige tidsperioden fra EBV smitte til etablering av cellelinjer stasjoner kravet til raskere og mer pålitelige metoder for EBV-drevet B-celle vekst transformasjon. Ved hjelp av en kombinasjon av høy titer EBV og et immundempende middel, er vi i stand til å konsekvent infisere, transform, og generere LCL fra B-celler i perifert blod. Denne metoden bruker en liten mengde perifert blod mononukleære celler som er infisert in vitro klynger av celler kan påvises. Tilstedeværelse av CD23 med EBV i nærvær av FK506, en T celle immunsuppressiv. Tradisjonelt er utvekst av prolifererende B-celler overvåkes ved visualisering av mikroskopiske klynger av celler omtrent en uke etter infeksjon med EBV. Klumper av LCL kan ses med det blotte øyet etter flere uker. Vi beskriver en analyse for å avgjøre tidlig hvis EBV-mediert growth transformasjon er vellykket selv før mikroskopiske klynger av celler kan påvises. Tilstedeværelsen av CD23 hi CD58 + celler observert så tidlig som tre dager etter smitte indikerer et vellykket resultat.
Metoden er beskrevet i denne artikkelen genererer LCL fra donor perifert blod med rask immortalization og nedfrysing ganger. Gjennom bruk av FK506, en T-celle immunosuppressiv, og høy titere av smittsomme virus vi er i stand til å fremme spredning av EBV-infiserte B-celler fra perifert blod mononukleære celler. Disse tiltakene gjør den beskrevne metoden mer effektiv, noe som resulterer i rask ekspansjon av celler for senere eksperimenter.
Tradisjonelt har veksten transformasjon blitt overvåket ved visualisering av klynger av cellene ved lysmikroskopi ca en uke etter eksponering til 6 EBV, 15. Imidlertid er clustering av celler ikke en spesifikk indikator på EBV-mediert vekst transformasjon. Vi har tidligere vist konsistent identifisering av proliferating celle befolkningen via flowcytometri 14, som gir en nøyaktig og spesifikk metode for å avgjøre vellykket resultat så tidlig som tre dager akteruter eksponering av B-celler til EBV.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av NIH bevilgninger K08 AI062732, K12 HD001401 og 1UL1RR024139-02 og en Child Health Research Grant fra Charles H. Hood Foundation til SB-M. og ved Research Foundation ved State University of New York ved Stony Brook.
Company | Catalog number | |
Amphotericin B | Fisher Bioreagents | BP 928-250 |
Dimethylsulfoxide | Sigma | D 2650 |
Fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F 4135 |
Ficoll Hypaque lymphocyte separation media | Mediatech | 25-072 |
FK506 | A.G Scientific | F 1030 |
IgG from mouse serum | Sigma | I 8765 |
Mouse anti-human CD23 conjugated to PE | BD Pharmingen | 555711 |
Mouse isotype IgG1 conjugated to PE | BD Pharmingen | 554680 |
Mouse anti-human CD58 conjugated to FITC | Pierce Thermo Scientific | MA1-82159 |
Mouse isotype IgG1 conjugated to FITC | BD Pharmingen | 550616 |
Mouse anti-human CD19 conjugated to PE-Cy5 | BD Pharmingen | 555414 |
Mouse isotype IgG1 conjugated to PE-Cy5 | Dako | X 0955 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 |
RPMI 1640 media | Sigma | R 8758 |
Tetradecanoyl phorbol acetate (TPA) | Calbiochem | 407952 |
FACS Buffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% Fetal Bovine Serum) |