توضح هذه المقالة الطرق لاستخلاص اليورانيوم من السكان الفئران الخلايا السليفة oligodendrocyte (OPCs) في الثقافة الأولية ، والتي تفرق لإنتاج oligodendrocytes ناضجة (شريان الحياة). بالإضافة ، فإن هذا التقرير يصف التقنيات لانتاج الفئران myelinating المشترك الثقافات OPCs بذر الماوس على سرير neurite من الخلايا العصبية الظهرية الماوس العقدة الجذر (DRGNs).
تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء التنمية رأ ليس فقط ضروري لتعزيز معرفتنا البيولوجيا الرتب الأخرى ، ولكن أيضا لفهم الآثار المرضية للأمراض المزيل مثل التصلب المتعدد (MS). تدرس عادة الخليوي تطوير النماذج الأولية مع ثقافة الخلية. زراعة الخلايا الأولية يسهل تقييم لإعطاء نوع من الخلايا من خلال توفير بيئة تسيطر عليها ، وخالية من المتغيرات الدخيلة التي تكون موجودة في الجسم الحي. في حين أن الثقافات رأ المستمدة من الفئران وفرت كمية هائلة من نظرة ثاقبة البيولوجيا OL ، وقد اجتمعت جهود مماثلة في إرساء ثقافات رأ من الفئران مع العقبات الرئيسية. تطوير أساليب عملية شريان الحياة لثقافة الفئران الأولية لا بد من أجل الاستفادة من خطوط الماوس المعدلة وراثيا المتوفرة.
وقد وصفت وسائل متعددة لاستخراج OPCs من أنسجة القوارض ، بدءا من neurosphere الاشتقاق ، والفرق تنقية التصاق immunopurification 1-3. بينما تقدم العديد من أساليب النجاح ، والأكثر ثقافة واسعة تتطلب مرات و / أو معدات مكلفة / الكواشف. للتحايل على هذا ، وتنقية OPCs من أنسجة الفئران مع تكييف الطريقة الموصوفة في الأصل من قبل Vellis مكارثي & دي 2 هو المفضل. هذا الأسلوب ينطوي على OPCs جسديا فصل من ثقافة الدبقية المختلطة المستمدة من القشور القوارض الولدان. والنتيجة هي مجموعة من السكان OPC المنقى التي يمكن أن تكون متمايزة في ثقافة OL – المخصب. هذا النهج هو جذابة بسبب الوقت القصير نسبيا على ثقافتها وشرط ضروري لعوامل النمو أو الأضداد immunopanning.
في حين استكشاف آليات التنمية رأ في ثقافة المنقى غني بالمعلومات ، فإنه لا يوفر البيئة الأكثر ملاءمة فيزيولوجيا لتقييم المايلين غمد تشكيل. وشارك في زرع شريان الحياة للسودان مع الخلايا العصبية تقديم نظرة ثاقبة على الأسس الجزيئية التي تنظم رأ بوساطة تكون الميالين من المحاور. بالنسبة للعديد من رأ / عصبون شارك في دراسات ثقافة ، وقد أثبتت الخلايا العصبية الظهرية العقدة الجذر (DRGNs) لتكون من نوع الخلايا العصبية في الاختيار. وهي مثالية للثقافة بالتعاون مع عملية شريان الحياة الخاصة بهم نظرا لسهولة استخراج ، كمية ضئيلة من الخلايا الملوثة ، وتشكيل أسرة neurite الكثيفة. بينما تم نشر الدراسات التي تستخدم الفئران / الماوس myelinating xenocultures 4-6 ، طريقة لاستخلاص هذه رأ / DRGN myelinating شارك في ثقافات ما بعد الولادة من أنسجة الفئران لم يتم وصفها. هنا نقدم طرق تفصيلية بشأن كيفية إنتاج مثل هذه الثقافات على نحو فعال ، جنبا إلى جنب مع أمثلة من النتائج المتوقعة. هذه الطرق مفيدة لمعالجة المسائل ذات الصلة بالتنمية رأ / الوظيفة myelinating ، وأدوات مفيدة في مجال علم الأعصاب.
هذا التقرير يصف طريقة لعزل OPCs الفئران عن التمايز في الثقافات OL – OL المخصب أو / DRGN المشترك الثقافات. عند المثقف وحده ، OPCs تفرق في عملية شريان الحياة MBP + هاء ، وإنتاج النخاعين مثل أوراق غشائي. عندما تضاف إلى أسرة DRGN neurite ، شريان الحياة في غلف neurites DRGN مع MBP + غشاء هاء. هذا النموذج يفيد التحقيق في الأسس التي تحكم معقدة رأ بوساطة ensheathment محواري.
في حين أن قيمة كبيرة ، وإنشاء مثل هذه الثقافات يشكل تحديا تقنيا. على وجه الخصوص ، وتشمل الجوانب تطالب كفاءة الهضم الأنسجة / التفكك ، والحفاظ على توازن درجة الحموضة ثقافة الإعلام ، والتغيرات DRGN وسائل الإعلام. من المهم أن نرى أن طول الهضم ، ويجري استيعاب كمية الأنسجة وكمية سحن يؤثر على فعالية ونتيجة نهاية تفارق الأنسجة. ليس من غير المألوف بالنسبة للباحثين من ذوي الخبرة للحصول على غلة الخلوية منخفضة من فصل أنسجة الجهاز العصبي. بالإضافة إلى ذلك ، OPCs الفئران تميل إلى أن تكون حساسة للتغيرات في درجة الحموضة وسائل الإعلام والثقافة ، وخاصة في ظل الظروف القلوية. الحفاظ على الثقافات في CO 2 و 8.5 ٪ يهدف إلى منع حدوث ذلك ، تظهر منذ OPCs على تحمل الظروف الحمضية أفضل بقليل الأساسية. فيما يتعلق DRGNs التغذية ، ويجب إجراء تغييرات وسائل الإعلام بسرعة حتى لا يجفف الخلايا العصبية ، ومع ذلك ، يجب أن يكون لطيف حتى لا تعطل السرير neurite النامية. وسائل الاعلام قد المفاجئ التغييرات طرد من السرير neurite الركيزة ، ويؤدي على الأرجح في التفكك التام من ساترة.
ميزة المحتملة لهذا النظام النموذجي يلقي بظلاله بشكل كبير طبيعته تطالب تقنيا. ميزة واحدة من هذا النظام هو استخدام ما بعد الولادة الفئران لاشتقاق ثقافة الخلية ، ملتفا على ضرورة التضحية تربية الإناث لحصاد الأنسجة الجنينية. ميزة أخرى هي عدم وجود شرط لعوامل النمو (GFS) للتوسع في OPCs. ثقافات مختلطة الدبقية توفير بيئة تدعم نشر OPCs ، ويفترض أن يعود إلى وجود عوامل التغذية نجمية المشتقة. أساليب أخرى ، مثل الاشتقاق عبر neurospheres 7،8 ، تعتمد على خصائص مولد للتفتل من GFS مثل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، عامل نمو البشرة (EGF) وصفائح المستمدة عامل النمو (PDGF) للتوسع OPC. وبالمثل ، وذلك باستخدام ما بعد الولادة (P5 – 10) الفئران ليتجنب DRGNs شرط المكمل لثقافة الإعلام مع عامل نمو الاعصاب (NGF) ، وهو عامل التغذية العصبية اللازمة للبقاء على قيد الحياة في المختبر من DRGNs الجنينية 9 و 10. فمن مصلحة لتجنب استخدام NGF كما أنه يؤثر سلبا على قدرة myelinating عملية شريان الحياة عند المثقف مع DRGNs 4. تجنب استخدام GF – تستكمل وسائل الإعلام أيضا فوائد اقتصادية ، إذ أن هذه الكواشف تصبح مكلفة عند استخدامها على نطاق واسع.
ولعل أهم فائدة من هذا النموذج هو ثقافة الاشتقاق من الماوس فقط الأنسجة ، وبالتالي توفير الفرص لاستخلاص كل من OPCs وDRGNs من تشكيلة واسعة من خطوط الفأر المعدل وراثيا. وهذا يسمح لدراسة كل من و / أو DRGN OPC محددة الخصائص التي تحكم تكون الميالين. وسوف يكون هذا أهمية خاصة بالنسبة للتوضيح التفاعلات مستقبلات / يجند تنظيم رأ بوساطة تكون الميالين من المحاور. في كل شيء ، هذه التقنية هي ذات قيمة كبيرة بالنسبة للبحوث علم الأعصاب بسبب تطبيقاتها نحو فهم الاشارات الجزيئية الكامنة وراء تكون الميالين.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا المشروع من خلال منحة من جمعية التصلب المتعدد لكندا RKRWO هي المستفيدة من دراسية لمن جمعية التصلب المتعدد في كندا. حقوق السحب الخاصة هي المستفيدة من المنح الدراسية ما بعد الدكتوراه من جمعية التصلب المتعدد من كندا والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة.
Product Name | Company | Product Number |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Multicell | 319-005-CL |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 |
Minimum Essential Media (MEM) | GIBCO | 12360-038 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 10091-148 |
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | GIBCO | 15140-122 |
GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 |
Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 |
Human merosin purified protein (LN2) | Millipore | CC085 |
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF) | PeproTech | 450-50 |
L-thyroxine | Biochemika | 89430 |
Holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T0665 |
B27 supplement | GIBCO | 0080085-SA |
Bovine insulin | Sigma-Aldrich | I6634 |
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | I6634 |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 |
Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 |
Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FuDR) | Sigma-Aldrich | F0503 |
Papain solution | Worthington | LS003126 |
DNaseI | ROCHE | 1010159001 |
L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 |
24-well tissue culture dishes | Cellstar | 662-160 |
T25-tissue culture flasks with vent cap | Corning | 430639 |
10 cm tissue culture dishes | Corning | 430167 |
10 cm petri dish | Fisher Scientific | 0875713 |
Collagenase A | ROCHE | 103578 |
CellTrics 50 μm filter (optional) | PARTEC | 04-004-2327 |
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody | AbD Serotec | MCA409S |
NG2 antibody | Millipore | AB5320 |
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody | Millipore | MAB1567 |
2′,3′-Cyclic-nucleotide 3′-phosphodiesterase (CNP) antibody | Covance | SMI-91R-100 |
Actin pan Ab-5 antibody | Fitzgerald | 10R-A106AX |
Neurofilament-200 (NF) antibody | Sigma-Aldrich | N4142 |
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody | Millipore | MAB5544 |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11008 |
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A21422 |
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A21247 |
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody | BioRad | 170-6516 |
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2065 |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 |
Media Recipes
100X OL-Supplement*
Ingredient | Amount to add |
DMEM | 100 mL |
BSA | 1.02 g |
Progesterone | 0.6 mg |
Putrescine | 161 mg |
Sodium Selenite | 0.05 mg |
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine | 4 mg |
*Store at -80°C in 250 μL aliquots
OL media
Ingredient | Amount to add |
DMEM | 23.75 mL |
100X OL-Supplement | 250 μL |
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock) | 125 μL |
GlutaMAX | 250 μL |
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock) | 37.5 μL |
B27 Supplement | 500 μL |
FBS | 125 μL |
CNTF (from 50 ng/μL stock) | 25 μL |
Mixed glial culture media (made up in DMEM)
Ingredient | Final concentration |
FBS | 10% |
Pen/Strep (0.33% from stock) | 33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin |
GlutaMAX | 1% |
DRGN media (made up in DMEM)
Ingredient | Final concentration |
FBS | 10% |
Pen/Strep (1% from stock) | 100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin |
Digestion Solution Recipes:
OPC papain solution (made up in MEM)
Ingredient | Final concentration |
Papain solution | 1.54 mg/mL |
L-cysteine | 360 μg/mL |
DNaseI | 60 μg/mL |
DRG papain solution (made up in HBSS)
Ingredient | Final concentration |
Papain | 1.54 mg/mL |
L-cysteine | 360 μg/mL |
DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)
Ingredient | Final concentration |
Collagenase A | 4 mg/mL |