Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Summary

Bu makale, olgun oligodendrosit (EKK) üretmek için ayırt primer kültür fare oligodendrosit öncü hücreler (OPC) zenginleştirilmiş nüfus, elde etmek için yöntemler anlatılmaktadır. Buna ek olarak, bu rapor üretmek için teknikler açıklar fare fare dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) neurite yatağa fare OPC ekim ortak kültürler myelinating.

Abstract

OL geliştirme altında yatan moleküler mekanizmaları belirleme OL biyoloji bilgimizi ilerletmek için yalnızca kritik değil, Multipl Skleroz (MS) gibi demiyelinizan hastalıkların patogenezinde anlamak için de etkileri vardır. Hücresel gelişimi sık primer hücre kültür modelleri ile çalışılmaktadır. Primer hücre kültürü, in vivo olarak bulunan gereksiz değişkenlerin kontrollü bir ortam sağlayarak, belirli bir hücre tipi değerlendirilmesi kolaylaştırır . Sıçanlarda türetilen OL kültürler OL biyoloji içgörü büyük bir miktar olsa da, fareler OL kültürler kurmayı benzer çabalar büyük engellerden ile karşılandı. Transgenik fare hatları yararlanmak amacıyla kültür fare primer OLS için yöntemler geliştirmek zorunludur.

Neurosphere türev, diferansiyel yapışma arıtma ve ^1-3 immunopurification arasında değişen, kemirgen dokusundan OPC çıkarılması için birden çok yöntem tarif edilmiştir. Pek çok yöntem başarı sunarken, en kapsamlı kültür ve / veya pahalı ekipman / reaktifler gerektirir. Bunu aşmak için, başlangıçta McCarthy & de Vellis ² tarafından açıklanan yöntemi bir adaptasyon fare doku OPC arındırıcı tercih edilir. Bu yöntem, fiziksel neonatal kemirgen korteks türetilen karışık bir glial kültüründen ayıran OPC içerir. Sonuç, bir saflaştırılmış OPC nüfusu OL-zenginleştirilmiş kültür ayrılabilir. Bu yaklaşım, görece kısa bir kültür zaman ve büyüme faktörleri veya immunopanning antikorlar için gereksiz gereksinimi nedeniyle itiraz ediyor.

, Saflaştırılmış bir kültür OL gelişme mekanizmaları keşfetmek bilgilendirici olmasına rağmen, miyelin kılıf oluşumu değerlendiren için en önemli fizyolojik bir ortam sağlamaz. Co-kültür OLS nöron aksonları OL-aracılı miyelinasyonun düzenleyen moleküler temellerinin içgörü ödünç. / OL nöron ko-kültür çalışmaları birçok insan için, dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) seçim nöron türü olduğu kanıtlanmış. Ekstraksiyon, kirlenmesine neden olan hücreler az miktarda ve yoğun neurite yatak oluşumu kolaylığı nedeniyle OLS ile ko-kültür için idealdir. ^4-6 xenocultures myelinating sıçan / fare kullanarak çalışmalar yayınlanmış olsa da, böyle derivasyon için bir yöntem DRGN / OL post-natal fare doku ortak kültürler myelinating tanımlanmıştır değil. Burada etkili beklenen sonuçlar örnekleri ile birlikte, bu tür kültür üretmek için nasıl ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Bu yöntemler OL geliştirme / myelinating fonksiyonu ile ilgili sorulara yanıt için yararlı ve faydalı araçlar sinirbilim alanında.

Protocol

Etik Beyanı

Bu çalışmada kullanılan fareler, Kanada Hayvan Bakım Konseyi (CCAC) yönergeleri doğrultusunda bakım. Ottawa Hayvan Bakımı Komitesi Üniversitesi OGH-119 protokol numarası altında yapılan deneyler için etik kurul onayı alınmıştır.

1. Diseksiyon - OPC ekstraksiyonu için yenidoğan fare korteks

1. Kurumsal kurallarına göre P0-P2 fare Kurban.
2. Buz MEM (antibiyotik ücretsiz) içeren bir Petri kabındaki beyin ve yer ayır.
3. Diseksiyon mikroskobu çanak aktarın.
4. Sagittally beyin dorsal yüzü bir neşter kullanarak, her korteks (Şekil 1a) en medial kenarı boyunca sığ bir kesi olun. Bu kesi sadece onun kaldırma kolaylaştırmak amacıyla meningeal katmanı üzerinden geçmelidir.
5. Lateral moda menenjlerde soyulabilir ince uçlu forseps kullanın. Dikkatli bir şekilde yapılırsa, bu katman tek parça halinde çıkarılabilir. Bu adım sırasında, koku ampuller çıkarın.
6. Beynin ventral taraf-up ile korteks ve ventral diensefalon alanı (Şekil 1b) karşılayan bir derin sagital kesi yapmak.
7. Yan beyin dorsal doku yanal moda (Şekil 1c, c) medial meraklı orta beyin korteks ayırın. Bu aşamada herhangi bir kalıntı meninksler çıkarın.
8. Yaklaşık 4 adet her korteks Zar ve yavaşça 15 ml konik tüp 350 mcL MEM başına fare beyin içeren bir transfer. Tüm fareler işlendikten kadar buz üzerinde tüp tutun.
9. Kalan fareler için 1,1-1,8 adımları tekrarlayın.

2. Karma glial kültürlerin neonatal korteks ve bakım Fototerapisi

Not: baloncuklar hücre süspansiyonu içine giriş aşağıdaki adımları sırasında kaçınılmalıdır.

1. 3 dakika süreyle 37 ° C su banyosunda taze disseke beyinleri içeren 15 ml konik tüp ekleyin.
2. Steril doku kültürü kaputu beyinleri aktarın.
3. Yavaşça küçük parçaları oluşturmak için P1000 pipet ile doğranmış korteks geçmektedir. Hiçbir beyin adet pipet ucu ile süspansiyon düzgün bir şekilde akışını kesintiye uğratmak için yeterince büyük bir pipetleme durdurun.
4. Başına OPC papain beyin çözüm konik tüp içine 75 mcL ekleyin. OPC papain çözümü 37 önceden ısıtılmış olmalıdır ° C de 20 dakika önce için kullanmak.
5. 20 dakika süreyle 37 ° C su banyosunda inkübe edin. Yaklaşık her 2 dakika, doku agregasyonunu önlemek için tüp hafifçe çevirin. Bu süre boyunca, her 37 ° C doku kültürü inkübatör poli-L-lisin (PLL) kaplamalı (1 mg / ml) T25 balonuna (fare beyin başına bir balon) ve yerde 5 mL karışık glial kültür ortamı eklemek % 8.5 CO _2.
6. 20 dakika sonra, steril kaput doku süspansiyonu dönmek ve beyin başına karışık glial kültür ortamı tüpüne 2 mL ekleyin. OPC papain çözüm inaktivasyon izin için 10 dakika oda sıcaklığında bekletin.
7. 5 ml plastik tüpler içine kısım doku süspansiyon. Tüpler, tüp başına yaklaşık 2.5 mL disseke beyinlerin numarası eşleşmesi gerekir.
8. Steril bir alev parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanarak, her tüp hafifçe doku çiğnemek. Ilk başta yavaş yavaş Karışım ve parçaları ayrıştırmaları kademeli olarak hızını artırmak. Karışım, yaklaşık 10-15 kez bu sayı, ancak sindirim etkinliğini göre değişebilir.

Not: Under-öğütme, aşırı-öğütme hücre canlılığı üzerindeki olumsuz etkisi ise doku yoksul disosiyasyon neden olacaktır. Bu hücre canlılığı ciddi bir etkisi olarak, çözüm kabarcıkları tanıtmak için çok önemlidir.

9. Bir kez süspansiyon kalan görünür doku kümeleri vardır, 4 mL beyin başına karışık glial kültür ortamı (yani, 4 beyinleri = 16 mL karışık glial kültür ortamı) içeren 50 ml konik tüp transferi .
10. Kalan 5 ml tüpler için 50 ml konik tüp ve tekrar yavaşça çevirin.
11. (15 ml tüp başına yaklaşık 6.5 ml) 15 ml konik tüpler içine kısım toplanmış hücre süspansiyonu. 15 ml tüpler disseke beyinlerin sayısını eşleşmesi gerekir.
12. 5 dakika boyunca 1200 rpm (~ 300 g), tüplerin santrifüjleyin.
13. Süpernatantı dikkatlice aspire ve her 15 ml konik tüp için 1 ml sıcak karışık glial kültür ortamı eklemek.
14. Yavaş yavaş baloncuklar tanıtmak için dikkatli, P1000 bir pipet ile pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Toplam 6 mL kültür ortamı volume rendering hücre süspansiyonu, her tüpten bir ön dengelenmiş PLL kaplı T25 balon ekleyin.
15. 3-4 saat için bir doku kültürü inkübatör şişeler hücreleri PLL substrat eklemek için izin yerleştirin. Medya pipetleme ve şişeler taze karışık glial kültür ortamı 6 ml ekleyerek tam bir medya değişiklik yapın. Bu adım çok enkaz kaldırıröğütme yol açtığı ve kültür canlılığı arttırır. Co-kültür DRGN / OL istenirse, bu protokolün Bölüm 3'e bakın.
16. Kültür 3 gün sonra, 4 mL medya kaldırılması, ve 4 mL taze karışık glial kültür ortamı ile değiştirilmesi 2 / 3 medya değişim gerçekleştirmek. Bu noktada, bir şişe baz astrosit tek tabaka oluşturan olmalıdır.
17. 6. Gün, 2 / 3 medya son bir konsantrasyon ile 5 mg / ml insülin şişeler değiştirmek ve ek gerçekleştirin. Bu noktada, bir astrosit tek tabaka üstüne OPC prolifere olacağı açıkça görünür olmalıdır.

3. DRGN izolasyon

Not: ortak kültürler DRGNs / OL DRGNs karışık glial kültür nesilden gün kurulmuş olmalıdır üretmek için kullanılır. Her iki kültür tipleri bağımsız olarak büyüdü ve 9-10 gün sonra birleştirilir.

1. Kurban P5-P10 kurumsal kurallarına göre fare.
2. Omurga Özü, ve temiz bir Petri kabı transfer.
3. Dorsal kök gangliyon (DRG) diseksiyonu kolaylığı gibi, omurga (Şekil 1d, d ') mümkün olduğunca fazla kas ve kemik gibi uzak kesin.
4. Yeni bir Petri kabı ventral taraf-up için kesilmiş omurga aktarın. Diseksiyon makas kullanma ve kaudal başlangıç, uzunlamasına bir moda omurga üzerinden mediale kesti.
5. Forseps, iki çift kullanarak, hafifçe omurilik maruz omuriliğe açmak gözetlemek.
6. DRG'ler altında bulunan ve spinal kord lateral olabilir. Ganglia (Şekil 1e) zarar kaçınırken, ince uçlu forseps kullanarak hafifçe DRG'ler kaldırmak.
7. Çıkarılan DRG'ler yeni bir Petri kabındaki buz Hank tamponlu tuz solüsyonu (HBSS, antibiyotik-free) aktarın. Disektör fare başına 40 DRG'ler (Şekil 1f) ayıklamak amacı olmalıdır.
8. DRG'ler ayıklandıktan sonra, kültür kirlenmesine neden olan hücreleri giriş (glial hücreler, fibroblastlar) en aza indirmek için herhangi bir aşırı uzun kökleri (Şekil 1g, g ') DRG'ler kırpın.
9. DRG'ler 500 mcL buz HBSS içeren 1.5 ml santrifüj tüpüne aktarın.
10. 4 5 dakika 1200 rpm (~ 300 g) ° C pelet DRG'ler santrifüjleyin.
11. Steril doku kültürü kaputu santrifüj tüplerine transferi ve tüpler HBSS kaldırmak.
12. Önceden ısıtılmış 500 mcL ekleyin (20 dakika 37 ° C) DRG papain çözümü, tüpler ve 10 dakika süreyle 37 ° C su banyosunda inkübe edin. Tüpler doku agregasyonunu önlemek için her 2 dakikada bir ters çevirin.
13. 3.10 adımı tekrarlayın.
14. DRG papain çözüm çıkarın ve kollajenaz bir çözüm önceden ısıtılmış (37 ° C'de 20 dakika) 500 mcL ekleyin. 10 dakika, 2 dakika tersini her 37 ° C'lik su banyosunda inkübe edin.
15. 3.10 adımı tekrarlayın.
16. Süpernatantı ve DRGN medya 1 ml ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirin.
17. 3.10 adımı tekrarlayın.
18. 3.16 adımı tekrarlayın.
19. Kat HBSS birkaç kez% 0.25 BSA bir çözüm pipetleme (BSA), sığır serum albümini ile steril bir alev parlatılmış cam Pasteur pipeti. BSA çözümü ile kaplama, cam pipet duvarlarına yapışmış DRG'ler önleyecektir.
20. Ilk bakışta BSA ile kaplanmış pipet yardımıyla hafifçe DRG'ler Karışım ve artan yoğunluğu ile kümeleri dissociating başlar kez. Karışım, yaklaşık 10-15 kez bu sayı, ancak sindirim derecesine bağlıdır ve tüp başına DRG'ler sayısı.
21. Disosiasyon elde sonra, 7 ml DRGN medya içeren steril bir Petri kabı içine filtre 50 mikron ile süspansiyon geçmektedir. Filtrasyon, bu adımı çok önemli olmasa da hücre süspansiyonu enkaz ortadan kaldıracaktır.
22. % 8.5 CO ₂ Petri kabı, yaklaşık 1.25 saat inkübe edin .
23. Bu inkübasyon süresi boyunca 24-iyi bir çanak LN2 (PBS içinde 10 mcg / ml) ile Kat birkaç 12 mm lamelleri.
24. Inkübasyon bittiğinde altında Petri kabı, parlak bir alan gözlemliyoruz. DRGNs geniş gövdeli, faz karanlık hücreler olarak tanımlanır. Herhangi bir yapıştırılır DRGNs kaldırmak için hafifçe Swirl Petri kabı.

Not: Birçok kirlenmesine neden olan hücreleri güçlü, böylece DRGNs hücre süspansiyonu zenginleştirici, Petri kabı yapıştırılır olacak.

25. 15 ml konik tüp hücre süspansiyonu aktarın. Yavaşça herhangi bir kalıntı DRGNs toplamak için DRGN medya 4 mL çanak durulayın. Konik tüp için ek 4 mL aktarın.
26. 1200 rpm (~ 300 g) 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
27. Süpernatant aspire edin ve taze DRGN medya 500 mcL pelet tekrar süspansiyon.
28. Hemasitometre kullanarak vermiştir DRGNs sayısını hesaplayın. DRGNs ve diğer hücre tipleri sadece saymak emin olun. DRGNs büyük küresel hücre organları tarafından tespit edilebilir.
29. Bir gecede% 8.5 CO ₂ DRGN medya 1 mL her LN2 kaplı lamel ve 37 ° C doku kültürü inkübatör yer Seed 30,000-50,000 DRGNs.
30. Ertesi sabah, DRGN yerini tam bir ortam değişikliği yapılması(eksi CNTF)% 1 Kalem / Strep ve 10 mcM FuDR son bir konsantrasyon ile OL medya ile medya.
31. Gün 3 ve 5, 3 / 4 Adım 3.30 olarak aynı medya ortamı değiştirmek gerçekleştirin.
32. Gün 7, OL medya (eksi CNTF, Pen / Strep, FuDR) ile tam bir medya değişim gerçekleştirmek.
33. 9. gününde, DRGNs geniş bir neurite yatak oluşturulur ve OPC ile birlikte kültürlü olmaya hazır olmalıdır.

4. OL-zenginleştirilmiş kültür veya DRGN / OL ortak kültürler kurulması için karışık glial kültürlerden gelen OPC saflaştırılması

1. Karışık glial kültür 9. gününde,% 5 CO ₂ doku kültürü inkübatör orbital çalkalayıcı şişeler aktarın. Orbital çalkalayıcı üretilen herhangi bir ısı karışık glial kültürlerin olumsuz etkilemesini önlemek için, boş T25 şişeler şişeler üstüne yerleştirin. Kültürlerin, 1 saat süreyle bu yeni inkübatör gelmesini sağlayın.
2. Matara dengelenmiş sonra, şişeler için 50 rpm'de 45 dakika sallayın. Bu titremesinin amacı, tek tabaka herhangi bir gevşek yapışık kirlenmesine neden olan hücreler ortadan kaldırmaktır.
3. Bir doku kültürü kaputu hücreleri hareket ettirin ve şişeler tüm medya kaldırmak. 4 mL 5 mg / ml insülin ile desteklenmiş taze karışık glial kültür ortamı değiştirin.
4. Şişeler geri çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve yaklaşık 3 saat boyunca gelmesini sağlayınız.
5. Matara dengelenmiş sonra, orbital çalkalayıcı güvenle tutturmak ve 220 rpm (gece) yaklaşık 16 saat şişeler sallamak.
6. Ertesi sabah, OLS DRGNs olmaması (yani, OL-zenginleştirilmiş kültür), LN2 (PBS içinde 10 mcg / ml) 1 saat ile birkaç kat steril 12 mm lamelleri yetiştirilen isteniyorsa. 24-iyi yemekleri lamelleri Transferi, bir OL medya yıkama tarafından takip PBS ile yıkayın. Her kuyuya OL medya 1 ml ekleyin ve% 8.5 CO ₂ dengeye.
7. % 5 az 10 cm doku kültürü yemekleri 30 dakika dengelenmesi için ₂ CO. Bir çanak her 2 şişeler için gerekli olacaktır. Bu askıya OPC ayırıcı yapışma zenginleştirme için kullanılır.
8. 30 dakika dengeleme süre geçtikten sonra, bulaşıkları sarsılmış şişeler medya transfer. Her çanak 10 cm çanak başına hücre süspansiyonu yaklaşık 8 ml eşit, 2 şişeler medya almak gerekir.
9. Yemekler 15 dakika nazik bir dürtme sağlarken,% 5 CO ₂ 30 dakika inkübe edin. Bu dürtmek OPC 10 cm çanak yapışmasını önlemeye yardımcı olacaktır.
10. Inkübasyon tamamlandıktan sonra, parlak bir alan altında bulaşıkları inceleyin. OPC genellikle 3-5 hücreleri küçük hücre kümeleri olarak tespit edildi ama bazen neurospheres benzeyen büyük bir araya toplanırlar. Olmayan birçok OL soy hücrelerin plaka tabanına sıkıca uyulmalıdır. Yavaşça girdap plakaları herhangi bir gevşek yapıştırılır OPC ayırmak ve 15 ml konik bir tüp içine her plaka hücre süspansiyonu transfer.
11. 5 dakika için 1200 rpm (~ 300 g) Santrifüj.
12. P200 pipet ile tabanda takip P1000 pipet ucu, 1 mL OL medya pelletini tekrar.
13. Hemasitometre kullanarak hücrelerin güvenin.
14. Zenginleştirilmiş OL kültürleri, tohum 25.000 - 50.000 OPC son hacmi 1 ml OL medya her 12 mm LN2 kaplı lamel.
15. DRGN ortak kültürler / OL bölümünden DRGNs tam OL medya (eksi CNTF) değişimi gerçekleştirmek için [3] ve OPC zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu 50.000 hücreler yavaşça ekleyin. OPC eklenmesi sırasında DRGN neurite yatak bozmayacak özen gösterin.
16. Yeri 37 ° C inkübatör kültürler ve% 8.5 CO ₂ fiksasyonu kadar kaldırarak önlemek. Murin OPC pH değişiklikleri ve inkübatör çıkarıldıktan duyarlı OL medya pH değiştirecektir. Ayrıca, hücre kültürleri çevresindeki boş kuyu dH ₂ O Ayrıca kültür ortamı buharlaşmasını önlemek, böylece OL medya içinde konsantrasyonları çözünenlerin dalgalanmaları en aza indirmek. Bu, OPC için daha tutarlı bir ortam sağlayacaktır.

5. Immünofloresan mikroskopi için kültürler İşleme

1. -20 ° C'de 15 dakika süreyle oda sıcaklığında 10 dakika, ya da% 3 paraformaldehid için% 100 metanol ile kültürler sabitleyin.
2. Lamelleri Permeabilize% 0.1 Triton X-100 10 dakika ile 1 saat,% 10 keçi serum fosfat tamponlu salin (PBS) ve blok ile yıkayın.
3. 4 gece çözümü engelleme seyreltilmiş primer antikorlar ile inkübe lamelleri ° C
4. PBS ile lamelleri 3 kere yıkayın ve 45 dakika için çözüm engelleme seyreltilmiş Alexa-Florlu konjuge sekonder antikor (Invitrogen) ile inkübe edin.
5. 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Counterstain ve lamelleri PBS ile birkaç kez yıkayın.
6. DAKO floresan Mount lamelleri orta montaj.
7. Slaytlar immünofloresan mikroskobu ile analiz edin. Bu protokol, slaytlar, Zeiss Axiovert 200M ters floresan ya ile analiz edildimikroskop veya konfokal mikroskop tarama Zeiss LSM 510 META lazer.

6. OL-zenginleştirilmiş kültürlerden gelen tüm hücre proteini çıkarma

1. 3 dakika buz, kuvöz ve serin 24-kuyu kültürler çıkarın.
2. Medya dikkatlice çıkarın ve 10-20 mcL lizis tamponu (0.1% pepstatin 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl,% 0.1 SDS,% 0.5 sodyum deoksikolatın,% 1 Triton X-100, aprotinin, PMSF, her kuyuya leupeptin, sodyum orthovanadate) (numune başına 8 kuyu en az tavsiye edilir).
3. Geniş çaplı bir P1000 pipet kullanarak kuyular Pençe ve 1.5 ml santrifüj tüpüne lizat aktarmak.
4. 30 ½ göstergesi şırınga ile yaklaşık 15 kez ve 30 dakika süreyle buz soğuk lizat iletin.
5. 15 dakika 4 ° C için 14.000 rpm (~ 20.000 g) Santrifüj tüpleri
6. Yeni santrifüj tüplerine ve mağaza supernatant transfer -80 ° C

7. Zenginleştirilmiş-OL kültür protein SDS-PAGE analizi

1. Standart% 12 poli-akrilamid jeller SDS-PAGE ile tampon azaltmada örnek başına 30 mg protein giderin.
2. PVDF membranlar üzerine yarı-kuru transfer jeller.
3. 1 saat süreyle% 5 Blok membranlar TBST süt tozu yağsız (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl,% 0.1 Tween-20).
4. Membranlar, 1 saat süreyle çözüm bloke seyreltilmiş primer antikorlar ile inkübe edin.
5. 10 dakika için TBST membranları 3 kez yıkayın.
6. Membranlar çözümü engelleme 45 dakika için HRP-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.
7. TBST ile membranlar birkaç kez yıkayın ve 5 dakika boyunca Amersham ECL Plus western blot tespit reaktifi (GE Healthcare) ile inkübe edin.
8. Standart bilimsel görüntüleme film ile protein bantları algılar.

8. Temsilcisi Sonuçlar:

Bu protokol, OPC astrosit karışık bir glial kültürü içinde bir tek tabaka genişletilmiştir. Bu karışık glial kültür P0-P2 yenidoğan fare korteks türetilmiştir. In vitro (div1) 1. gün, karışık glial kültürü, faz kontrast mikroskobu (Şekil 2a) görüldüğü gibi değişik morfolojileri ile hücreler içerir . DIV3, balonun tabanındaki bir astrosit tek tabaka oluşturacak şekilde başlar ve DIV8 az OPC tek tabaka yüzeyinde açıkça gözlenebilir. DIV9, prolifere OPC gecede yüksek hızda orbital sallayarak arındırılmalıdır yeterli yoğunluk ulaşmıştır. Arınma süreci tamamlandıktan sonra, sonuç bir OPC-zenginleştirilmiş hücre popülasyonu. Div1 sonrası arıtma, OPC birkaç süreçler (Şekil 2b) uzanan, basit morfoloji var. DIV3 yazılan arıtma, hücreler olgunlaşmamış EKK'nın anımsatan süreçlerin karmaşık bir ağda, genişletmiştir. DIV6 yazılan arıtma, arıtılmış OLS basık ve broşür gibi membran yapılar yansıtılan var. Bu morfolojik gelişimi EKK'nın in vitro olgunlaşma tipik .

İmmünofloresan mikroskopi saflaştırılmış hücreleri OL-soyundan (Şekil 3a) gösterir. Tohumlu başlangıçta ifade kondroitin sülfat proteoglikan (NG2) OPC, üç gün tohumlama (Şekil 3b) içinde myelin ilişkili glikoprotein (MAG) pozitif olgunlaşmamış OLS dönüşebilir. DIV6 anda birçok OLS ifade miyelin bazik protein (MBP) ve sahip tipik olgun OL morfolojisi. Yüzde OL-lineage hücreleri OL zenginleştirilmiş kültürleri (Şekil 3c) saflığını belirlemek için farklı zaman noktalarında ölçüldü. Div1 yazılan arıtma, kültürler 50 ±% 14 NG2 ^{+ ve} OPC, hiçbir MAG ^{+ ve} veya MBP ^{+ Ve} OLS. Bu saflaştırılmış OL-lineage hücreleri farklılaşmış OLS ihmal numaraları ile, ekim zamanında habercisi aşamasında gösterir. DIV3 bazı habercisi fenotip korumak ve NG2 kalırken, birçok OLS MAG ^{+ Ve} hücreleri (24 ±% 5.9) ayrılabilir + (13 ±% 8.0). DIV3, MAG ^{+ Ve} hücreleri (3.2% 1.2) küçük bir oranda da MBP ifade. DIV6, EKK'nın 20 ±% 5.9 MAG ⁺ 12 ±% 7.3 NG2 ^{+ ve} OPC olarak devam ^Ve iken. Buna ek olarak, kültür hücreleri içinde 21 ±% 9.3 MBP ^{+ Ve} bu kez noktada OLS. SDS-PAGE analizi, daha ölümcül (Şekil 3d olgun OLS ayırt etmek için kültürü içinde OPC yeteneğini gösteren 2'3'-siklik nükleotidin 3'-fosfodiesteraz (CNP) ve 6 günlük kültür dönemi boyunca MBP aşamalı ifade .) Olursak, bu veriler OPC OL olgunlaşma çalışma için uygun bir OL-zenginleştirilmiş kültür sistemi üreten bir araç olarak bu yöntem kurar.

Bu protokol, fare sadece doku kaynakları kullanarak DRGN / OL ortak kültürler kurmak için yöntemler de açıklamaktadır. Ancak, ortak kültür üretmek amacıyla, DRGNs ilk kez tek başına yeterli bir neurite ağ oluşturmak için kültür olmalıdır. Bu post-natal fare nöron kültürleri kirlenmesine neden olan fibroblastlar ve gl yayılması önlemek için 10 mcM FuDR takviyesi ile düşük serum medyada 9 gün için yetiştirilen ial hücreleri. In vitro 9 gün boyunca yoğun bir neurite yatak (Şekil 4a), izole DRGNs üretir. Bu neurite yatak nöronal belirteçlerinin nörofilaman 200 (NF) ve Tuj1 (Şekil 4b) immünopozitif. Bu noktada, saflaştırılmış OPC neurite yatak eklenebilir ve ortak kültürler myelinating üretmek için ek bir 6 gün kültüre.

Ko-kültür DRGN / OL, birçok MBP ^{+ Ve} OLS NF ^{+ ve} DRGN neurites (Şekil 5a) arasında gözlenen olabilir DIV6 anda. Daha yakından bir inceleme üzerine, EKK, onları sık sık ^{bir MBP} + ve membran (Şekil 5b, c) ensheathing, çok sayıda DRGN neurites ile temas kurmaya kanıtlandığı.

Şekil 1. Yenidoğan fare korteks ve DRG izolasyon belirli yönlerini Diseksiyon mikroskobu görüntüleri. (A) taze çıkarılan yenidoğan fare beyin Dorsal görünümü. Noktalı çizgiler kesiler meningeal tabakasının kaldırılmasını kolaylaştırmak için yapılmış olmalıdır alanı belirtir, (b) Ventral görüntüsü, beynin korteks ventral diensefalon karşılayan noktalı çizgiler alanı belirtir . Korteks izolasyonu yardım etmek için noktalı çizgiler boyunca derin kesiler yapılabilir gerekir. Beynin geri kalanı uzak korteks gözetlemek nasıl Görsel tasviri (c-c ') (d) taze izole P5-P10 fare omurga aşırı kas ve kemik (d) kırparak önce omuriliğe içinde DRG'ler (e) Yer ve (f) bir fare izole edilmelidir DRG'ler yaklaşık sayısı (g) DRG gerektiren uzun köklere sahip enzimatik sindirim önce kırparak. Noktalı çizgi kökler kesilmiş olmalı bölgede gösterir. Yazılan kök kırpma DRG (g ').

Şekil 2. OPC, glial karışık bir kültürün içinde genişletilmiş, saflaştırılmış ve daha sonra bir OL-zenginleştirilmiş kültür olarak farklılaşmış . (A), karışık glial kültürlerin farklı gelişim aşamalarında Faz kontrastlı görüntüler . Div1 birkaç basık hücreleri, hücreler yuvarlak görünür. Karışık glial kültür Tabakalaşma astrositler OPC prolifere edildiği termos, tabanı düzgün bir tek tabaka oluşturur DIV3 başlar. Birçok OPC DIV8 astrosit tek tabaka yüzeyine yapıştırılır (oklar) görülmektedir (b) karışık glial kültürü arınmış, div1 OPC sadece birkaç süreçleri genişletmiştir. DIV3, hücre ara-aşamalı EKK anımsatan birçok süreçleri, genişletmiştir. DIV6, basık OLS (yıldız) (kesikli çizgi) membranöz yaprak görünür. Ölçek barlar, 50 mm.

Şekil 3. OL-zenginleştirilmiş kültür Karakterizasyonu. (A) farklı gelişim aşamalarında izole OLS Konfokal görüntüler. NG2 ⁺ MAG ^{+ Ve} OLS birden fazla arborous süreçleri sahip ^ise ve OPC, basit morfoloji var . MBP ^{+ Ve} OLS membranöz miyelin gibi yaprak genişletilmiş. Ölçeği bar, 50 mikron (b) Saf OL-lineage hücreleri OPC olarak köken ve 6 DIV içinde MAG, MBP ^{+ ve + Ve} OLS farklılaşırlar. Hiçbiri MAG ^{+ ve} veya MBP ^{+ Ve} iken div1, tüm OPC, NG2 ^{+ ve.} DIV3, MAG ^{+ ve} birkaç MBP ^{+ Ve} OLS artık ortadadır. EKK'nın çoğunluğu kalan birkaç NG2 ^{+ ve} OPC ile, MAG ve MBP ^{+ ve} DIV6. Ölçeği bar, 100 mikron (c) Ortalama değerler ± SD DIV 6 farklı gelişim aşamalarında yüzde OL-lineage hücreleri. Div1, tüm OL-lineage hücreleri NG2 ⁺ 50 ^Ve, muhasebe ±% 14 toplam hücre kültürü içinde. DIV3 ve DIV6, OL-soyundan hücrelerin sırasıyla 36 ± 6.8 ve% 32 ±% 8.4, toplam hücre, NG2 arasında değişen oranlarda ^{oluşan +} ve ^{MAG +} ve ^{MBP +} Ve OLS. (D) SDS-PAGE ile yapıldı 6 SAYI kültür dönemi boyunca kademeli ifade OL-belirteçlerinin CNP ve MBP gösteren zenginleştirilmiş OL kültürler elde edilen protein.

Şekil 4. DRGN kültür öncesi OPC tohumlama Karakterizasyonu. (A) ön-OPC tohumlama 9 SAYI kültür dönemi üzerinde Faz DRGNs kontrastlı görüntüler. DRGNs birkaç süreçleri ile büyük gövdeli hücreleri gibi kaynaklanan ve giderek daha karmaşık neurite ağ üretirler. Ölçek çubuğu, 100 mikron (b), DIV9 (pre-OPC tohumlama) sabit ve nöron spesifik belirteçler Tuj1 ve NF200 lekeli DRGN kültürlerin Konfokal görüntüler . DRGNs OPC DRGN / OL ortak kültürler myelinating numaralı seribaşı olabilir bunun üzerine bir neurite ağ üretmişlerdir. Ölçeği bar, 50 mm.

ent ">
Şekil 5. EKK MBP DRGN neurites ^{+ ve} membran OL-aracılı sarma DRGNs sonucu ile birlikte kültüre. (A), DIV6 DRGN / OL ko-kültür, montaj 4-alan konfokal görüntü . Birçok MBP ^{+ Ve} OLS altta yatan DRGN neurite yatak ile etkileşim görülebilir. Ölçeği bar, 100 mikron (b) MBP büyütülmüş konfokal görünümü ⁺ çoklu DRGN neurites sarma ^ve OLS. Ölçeği bar, 50 mikron (c) bölge Dijital büyütme (b) DRGN neurite OL zarı ile sarılmış olduğu belirtilir. Ölçeği bar, 25 mm.

Discussion

Bu rapor, kültürleri ya da OL-zenginleştirilmiş DRGN / OL ortak kültürler farklılaşma fare OPC izole etmek için bir yöntem açıklanır. Yalnız kültür, OPC MBP içine ayırt ^{+ Ve} EKK, miyelin benzeri membranöz levha üretim. Neurite yatak DRGN eklendiği zaman, OLS MBP DRGN neurites sarmak ^{+ ve} membran. Bu model, OL-aracılı aksonal ensheathment yöneten karmaşık temellerinin araştırılması yarar sağlar.

Büyük bir değer olsa da, bu tür kültürlerin kurulması, teknik olarak çok zordur. Özellikle zorlu yönlerini etkili doku sindirim / disosiasyon, dengeli bir kültür ortamı pH bakım ve DRGN medya değişiklikleri içerir. Sindirim uzunluğu, doku miktarı sindirilir ve öğütme miktarı doku ayrılma etkinliği ve sonuçta etkiler olduğunu göz önünde bulundurmak önemlidir. Ayrışmış sinir sistemi dokularında düşük hücresel verimi elde etmek için deneyimli araştırmacılar için alışılmadık bir durum değildir. Buna ek olarak, fare OPC, özellikle alkali koşullar altında, kültür ortamı pH değişikliklerine duyarlı olma eğilimindedirler. % 8.5 CO ₂ kültürlerin bakım OPC temel üzerinde hafif asidik koşullarda daha iyi tolere görünen bu yana, bu önlemek için amaçlamaktadır. Ancak, medya değişiklikleri, beslenme DRGNs ile ilgili olarak, nöronlar ile kurutun olarak hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir olmalıdır gelişmekte neurite yatak bozmayacak gibi hafif olmalıdır. Ani medya değişiklikleri yüzey neurite yatak, ve lamel tam ayrılma olası sonuç yerinden olabilir.

Bu model sisteminin potansiyel liyakat, teknik açıdan zorlu doğa büyük ölçüde düşer. Bu sistemin bir avantajı, embriyonik doku hasat üreme kadın feda etmeye gerek engellemeyi, hücre kültürü derivasyon için post-natal farelerin kullanılması. Diğer bir avantajı OPC genişlemesi için büyüme faktörleri için gereğinin olmaması (GDS). Karışık glial kültürler astrosit türetilen trofik faktörlerin varlığı nedeniyle muhtemelen OPC yayılmasını destekleyen bir ortam sağlar. Türetme yoluyla neurospheres ^7,8 gibi diğer yöntemler, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) ve OPC genişleme için trombosit kökenli büyüme faktörü (PDGF) gibi GF'lerin mitojenik özellikleri güveniyor. Benzer şekilde, postnatal (P5-10) DRGNs için fareler kullanarak, sinir büyüme faktörü (NGF), embriyonik ^{DRGNs 9, 10,} in vitro hayatta kalmak için gerekli bir nörotrofik faktör ile kültür ortamı tamamlayan gereği önler . Ilgi DRGNs ⁴ ile kültüre EKK'nın myelinating kapasitesini olumsuz etkiler olarak NGF kullanmaktan kaçının. Kullanımı kaçınmak GF-desteklenmiş büyük ölçekte kullanılan bu reaktifler pahalı gibi medya da, ekonomik faydaları vardır.

Belki de bu kültürün modelin en önemli yararı, bu nedenle, transgenik fare hatları çok çeşitli OPC ve DRGNs elde etmek için fırsatlar sağlayarak, sadece fare dokuları türevidir. Bu her iki DRGN ve / veya miyelinasyonun yöneten OPC-spesifik özellikleri çalışma için izin verir. Bu aksonlar OL-aracılı miyelinasyonun düzenleyen reseptör / ligand etkileşimleri nedenlerine açıklık için özellikle önemli olacaktır. Bu teknikte, miyelinasyonun altında yatan moleküler ipuçları anlamaya yönelik uygulamaları nedeniyle nörolojik araştırma açısından büyük bir değer taşımaktadır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Multicell	319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112
Minimum Essential Media (MEM)	GIBCO, by Life Technologies	12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS)	GIBCO, by Life Technologies	10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep)	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Poly-l-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Human merosin purified protein (LN2)	EMD Millipore	CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF)	PeproTech Inc	450-50
L-thyroxine	Biochemika	89430
Holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T0665
B27 supplement	GIBCO, by Life Technologies	0080085-SA
Bovine insulin	Sigma-Aldrich	I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine	Sigma-Aldrich	I6634
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783
Putrescine	Sigma-Aldrich	P7505
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR)	Sigma-Aldrich	F0503
Papain solution	Worthington Biochemical	LS003126
DNaseI	Roche Group	1010159001
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
24-well tissue culture dishes	Cellstar	662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap	Corning	430639
10 cm tissue culture dishes	Corning	430167
10 cm petri dish	Fisher Scientific	0875713
Collagenase A	Roche Group	103578
CellTrics 50 μm filter (optional)	PARTEC	04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody	AbD Serotec	MCA409S
NG2 antibody	EMD Millipore	AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody	EMD Millipore	MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody	Covance	SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody	Fitzgerald	10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody	Sigma-Aldrich	N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody	EMD Millipore	MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody	Bio-Rad	170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
Media Recipes 100X OL-Supplement* Ingredient Amount to add DMEM 100 mL BSA 1.02 g Progesterone 0.6 mg Putrescine 161 mg Sodium Selenite 0.05 mg 3,3',5-Triiodo-L-thyronine 4 mg *Store at -80 °C in 250 μL aliquots OL media Ingredient Amount to add DMEM 23.75 mL 100X OL-Supplement 250 μL Bovine insulin (from 1 mg/mL stock) 125 μL GlutaMAX 250 μL Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock) 37.5 μL B27 Supplement 500 μL FBS 125 μL CNTF (from 50 ng/μL stock) 25 μL Mixed glial culture media (made up in DMEM) Ingredient Final concentration FBS 10% Pen/Strep (0.33% from stock) 33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin GlutaMAX 1% DRGN media (made up in DMEM) Ingredient Final concentration FBS 10% Pen/Strep (1% from stock) 100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin Digestion Solution Recipes: OPC papain solution (made up in MEM) Ingredient Final concentration Papain solution 1.54 mg/mL L-cysteine 360 μg/mL DNaseI 60 μg/mL DRG papain solution (made up in HBSS) Ingredient Final concentration Papain 1.54 mg/mL L-cysteine 360 μg/mL DRG Collagenase A solution (made up in HBSS) Ingredient Final concentration Collagenase A 4 mg/mL