En enkel og generel manuelle peptoid syntese metode, som indebærer grundlæggende udstyr og kommercielt tilgængelige reagenser er beskrevet, så peptoids at være let syntetiseret i de fleste laboratorier. Den syntese, oprensning og karakterisering af en amfifile peptoid 36mer beskrives, såvel som dens saml-selv i højt bestilt nanosheets.
Peptoids er en ny klasse af biomimetiske, ikke-naturlige, sekvens-specifikke heteropolymers at modstå proteolyse, udviser potent biologisk aktivitet, og vend det i højere orden nanostrukturer. Strukturelt ligner peptider, peptoids er poly nitrogensubstituerede Glycines, hvor sidekæder er knyttet til kvælstof i stedet for alpha-kulstof. Deres lethed af syntese og strukturelle mangfoldighed tillader afprøvning af grundlæggende design principper til at køre bil de novo design og konstruktion af nye biologisk aktive og nanostrukturerede materialer.
Her er en simpel manuel peptoid syntese protokol, præsenteret som gør det muligt syntesen af langkædede polypeptoids (op til 50mers) i fremragende udbytte. Kun grundlæggende udstyr, enkle teknikker (f.eks væsketransport, filtrering), og kommercielt tilgængelige reagenser er påkrævet, hvilket gør peptoids en tilgængelig foruden mange forskere 'værktøjskasser. Den peptoid backbone er vokset en monomer ad gangen modbl.a. den submonomer metode, som består af en to-trins monomer Ud cyklus: acylation og fordrivelse. Først bromoacetic Syreaktiveret in situ med N, N'-diisopropylcarbodiimide acylates en resin-bundet sekundære amin. For det andet, nukleofile forskydning af bromid ved en primær amin følger at indføre sidekæde. De to-trins cyklus gentages indtil den ønskede kædelængden er nået. Koblingen effektiviteten af denne to-trins cyklus rutinemæssigt overstiger 98% og muliggør syntesen af peptoids så længe som 50 rester. Meget afstemmelige, præcis og kemisk forskellige sekvenser er opnås med den submonomer metode som hundredvis af let tilgængelige primære aminer kan være direkte indarbejdet.
Peptoids dukker op som et alsidigt biomimetiske materiale til Nanobioscience forskning på grund af deres syntetiske fleksibilitet, robusthed, og bestille på det atomare niveau. Den foldning af en enkelt kæde, amfifile, information-rige polypeptoid til en yderst bestilt nanosheet blev for nylig demonstreret. Dette peptoid er en 36-mer, der kun består af tre forskellige kommercielt tilgængelige monomerer: hydrofobe, kationiske og anioniske. Den hydrofobe phenylethyl sidekæder er begravet i nanosheet kernen mens ioniske amin og carboxyl sidekæder justere på den hydrofile ansigter. Den peptoid nanosheets tjene som en potentiel platform for membran mimetika, protein mimetika, enhed fabrikation, og sensorer. Metoder til peptoid syntese, ark dannelse, og mikroskopi billedbehandling er beskrevet og giver en enkel metode til at sætte fremtidens peptoid nanosheet designs.
Applikationer og betydning
Denne protokol beskriver en enkel og effektiv metode til peptoid syntese og den vandige selvsamling af peptoids ind nanosheets. De fleste laboratorier er let i stand til syntese peptoids fordi billige materialer, grundlæggende ekspertise og ligetil teknikker udnyttes 4. Ligeledes selvsamling af ultra-tynde, højt bestilt nanosheets kræver blot gentaget vippe et hætteglas med en fortyndet vandig peptoid opløsning 2. Peptoids er lovende materialer til biomedicinske og nanoscience forskning, fordi de er robuste og syntetisk fleksible endnu sekvens-specifikke og meget afstemmelige 5. Peptoids har vist biologisk aktivitet (lægemidler 6,7, diagnostik 8, intracellulær levering 9-10) og foldning i hierarkiske nanostrukturer 3, 11-14. På grund af deres modulære syntese, kombinatorisk peptoid librVædderen 15-19 let kan syntetiseres og screenet for en lang række aktiviteter eller egenskaber. Især tjene nanosheets som en potentiel platform for to-dimensionelle display stilladser, membran mimetika, biologiske sensorer, protein mimetika og enhed fabrikation. Med de næsten uudtømmelig forskellige sekvenser muligt, er den rige peptoid forskning hurtigt ekspanderende.
Variabler i fast-fase submonomer syntese af polypeptoids
På grund af evnen til at vælge fra en utrolig stor og forskelligartet alfabet af monomerer 20, har behov for submonomer metode lejlighedsvise ændringer i de tilfælde, hvor et stigende koblingen effektiviteten af hvert trin vil forbedre det samlede produkt udbytte. Indarbejdelse af ubeskyttede heterocykliske sidekæder kræver brug af chloroacetic syre i stedet for bromoacetic syre 21. Udvidet fordrivelse gange og højereamin koncentrationer er normalt ansat efter ca 20 koblinger til lange peptoid sekvenser eller mindre nukleofile aminer. Opvarmning af reaktionen fartøj til 35 ° C, ved hjælp af en vand-kappe reaktion fartøj, er med til at drive reaktion. For højt flygtige aminer såsom isopropylamin, skal udvises forsigtighed for at undgå fordampning.
Aminer i form af en HCl-salt, såsom T-butyl beta-alanin HCl, skal være fri-baseret, inden de indsættes i fordrivelse reaktion. Dette kan opnås ved at opløse eller suspendere amin i DCM (~ 5g amine/25 ml DCM), og neutralisering med en ækvimolære opløsning af vandig natriumhydroxid i en skilletragt. Den DCM lag er indsamlet, og den vandige lag bliver vasket med ekstra DCM. Den kombinerede DCM lag er tørret over natriumsulfat og filtreret ind i en tareret rundkolbe. Fjern opløsningsmiddel ved roterende fordampning til at give en olie, og registrere produktet vægt.
During spaltningen skridt, TFA kavalergang cocktail og spaltning tid er afhængig af antallet og variationen af at beskytte anvendte grupper. Retningslinjer for spaltning cocktails ligner traditionelle peptid deprotection skel 1. Generelt er 10 minutter inkubationer kræves for sekvenser uden at beskytte grupper eller sekvenser med få meget syrelabil beskytte grupper (f.eks BOC, trityl). To timers inkubationer anbefales til sekvenser med mere vanskeligt at beskytte grupper (fx t-butyl ester, MTR, T) eller sekvenser med mange beskytte grupper for at sikre fuld deprotection i hver kæde. Rå peptoid produkter vil normalt opløses i acetonitril: vand 1:1 (v / v), men højere acetonitril Proportionerne er fælles med sidekæder med en høj samlet hydrofobicitet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Byoung-Chul Lee, Philip Choi og Samuel Ho for værdifuld hjælp. Dette arbejde blev udført på Molekylær Foundry på Lawrence Berkeley National Laboratory, som støttes af Kontoret for Videnskab, Office of Basic Energy Sciences, af det amerikanske Department of Energy under Kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231 og Defense Threat Reduction agenturet i henhold til Kontrakt nr.: IACRO-B0845281.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Dimethylformamide | EMD | EM-DX1726P-1 | 99+% |
N-methylpyrrolidinone | BDH | BDH1141-4LP | 99% |
Bromoacetic Acid | Acros Organics | 200000-106 | 99% |
4-Methylpiperidine | Sigma Aldrich | M73206 | 96% |
N,N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex | 001100 | 99.5% |
Dichloromethane | EMD | EMD-DX0835 | ACS grade |
Acetonitrile | EMD | EM-AX0145P-1 | 99.8% |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | T6508 | 99% |
Triisopropylsilane | Sigma Aldrich | 233781-10G | For TFA cleavage |
1,2-Dichloroethane | JT Baker | JTH076-33 | For siliconization of glass reaction vessels |
Phenethylamine | Sigma Aldrich | 407267-100ML | >99.5% Hydrophobic side-chain amine |
Boc-ethylenediamine | CNH Technologies | C-1112 | Cationic side-chain amine |
t-Butyl beta-alanine HCl | Chem-Impex International | 04407 | Anionic side-chain amine |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | C8982-10X10MG | For MALDI matrix |
Nile Red | Sigma Aldrich | 19123-10MG | For fluorescence Imaging |
Dichlorodimethylsilane | Sigma Aldrich | 80430-500G-F | For siliconization of glass reaction vessels |
Disposable PP fritted cartridge | Applied Separations | 2416 | 6 mL polypropylene cartridge with 20 mm PE frit |
Disposable 3 way luer adapter | Cole Parmer | 31200-80 | Stopcock for disposable manual synthesis reaction vessel |
Luer Lock ring | Cole Parmer | 45503-19 | ¼” fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
Fittings Luer | Cole Parmer | 45500-20 | ¼” fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
Disposable PP pipets | VWR | 16001-194 | For TFA transfers |
Luer lock plastic syringe | National Scientific | S7515-5 | 6 mL syringes |
1 dram glass vial | VWR | 66011-041 | With phenolic molded screw cap with polyvinyl-faced pulp liner |
20 mL scintillation vial | VWR | 66022-060 | With attached PP cap and pulp foil liner |
Secure-Seal adhesive spacer | Invitrogen | S-24736 | For fluorescence imaging |
Glass slides | Electron Microscopy Sciences | 63411 | For fluorescence imaging |
Cover slip | VWR | 48366-067 | For fluorescence imaging |
4” Silicon wafer | Ted Pella | 16007 | Pre-dice in 5×7 mm chips |
0.45 filter | VWR, Acrodisc | 28143-924 | For HPLC. PTFE membrane |
Agarose | BD | 212272 | For fluorescence imaging |
SPE Vacuum Manifold | Sigma Aldrich | 57044 | Example of SPE vacuum manifold |
Fritted glass vessel | Ace glass | 6402-12 | Porosity C frit |
Plasma Cleaner/Sterilizer | Harrick Plasma | PDC-32G | Example of plasma cleaner to prepare silicon chips for SEM |