Summary
ويرد بسيطة وعامة التوليف peptoid الطريقة اليدوية التي تنطوي على المعدات والكواشف الأساسية المتاحة تجاريا ، مما يمكن توليفها peptoids بسهولة في معظم المختبرات. يوصف التوليف ، وتنقية وتوصيف ل36mer peptoid amphiphilic ، وكذلك التجميع الذاتي حيز العالية أمر nanosheets.
Abstract
Peptoids هي فئة جديدة من بيوميمتيك ، غير الطبيعية تسلسل الخاصة التي تقاوم التحلل البروتيني heteropolymers ، المعرض نشاط بيولوجي محتمل ، وأضعاف النانو في أعلى الترتيب. يشبه في بنيته الببتيدات ، وبولي peptoids N - استبداله glycines ، حيث تعلق على الجانب سلاسل النيتروجين بدلا من الكربون ألفا. تخفيف بهم من التوليف والتنوع الهيكلي يسمح اختبار مبادئ التصميم الأساسية لمحرك دي نوفو تصميم وهندسة المواد الجديدة النشطة بيولوجيا وذات البنية النانومترية.
هنا ، هو تقديم دليل بسيط peptoid بروتوكول التوليف التي تسمح للتوليف polypeptoids سلسلة طويلة (تصل إلى 50mers) في غلة ممتازة. مطلوبة المعدات الأساسية فقط ، وتقنيات بسيطة (مثل نقل السائل ، والترشيح) ، والكواشف المتاحة تجاريا ، مما يجعل peptoids إضافة إلى مجموعة أدوات للوصول العديد من الباحثين. ويزرع في العمود الفقري peptoid one مونومر في وقت تIA submonomer الأسلوب الذي يتكون من مرحلتين مونومر دورة بالإضافة إلى ذلك : أسيلة والتشريد. أولا ، وحامض bromoacetic تفعيلها في الموقع مع N ، N' - diisopropylcarbodiimide acylates راتنج متجهة الأمينات الثانوية. الثانية ، والتشريد محب النواة من بروميد من الأمينات الأولية التالي لتقديم سلسلة من الجانبين. وكرر دورة على مرحلتين حتى يتم الوصول إلى طول السلسلة المطلوب. كفاءة اقتران هذه الدورة على مرحلتين يتجاوز عادة 98 ٪ ويمكن تجميع peptoids طالما 50 البقايا. سلاسل متنوعة الانضباطي للغاية ودقيقة وقابلة للتحقيق كيميائيا مع أسلوب submonomer كما يمكن أن المئات من الأمينات الأولية متوفرة بسهولة إدراجها مباشرة.
Peptoids آخذة في الظهور كمادة بيوميمتيك تنوعا للبحوث nanobioscience لما لها من قوة الاصطناعية ، والمرونة ، ويأمر على المستوى الذري. للطي من سلسلة واحدة ، انفورما ، amphiphilicوقد تجلى مؤخرا نشوئها الغنية polypeptoid الى nanosheet العالية المطلوبة. هذا هو peptoid 36 مير التي تتكون من المونومرات ثلاثة فقط متاحة تجاريا : مسعور ، وأنيوني الموجبة. ودفن مسعور سلاسل الجانب الفنيل في حين أن جوهر nanosheet أمين الأيونية وسلاسل محاذاة الجانب الكربوكسيل على وجوه ماء. وnanosheets peptoid بمثابة منصة المحتملة لmimetics الغشاء ، mimetics البروتين ، وتصنيع الجهاز ، وأجهزة الاستشعار. ووصف الطرق لتخليق peptoid ، وتشكيل ورقة ، والتصوير المجهري وتوفر طريقة بسيطة لتمكين التصاميم nanosheet peptoid المستقبل.
Protocol
1. المرحلة الصلبة التجميعي Submonomer من Polypeptoids
الصلبة مرحلة التوليف (SPS) هو أسلوب شائع يستخدم لتجميع تسلسل محدد البوليمرات الحيوية خطوة حكيمة ، بشكل مباشر على دعم الصلبة الخاملة مثل حبة راتنجات البوليمر. ارتفاع غلة اقتران وسهولة ازالة الزائدة المتفاعلة من المزايا الرئيسية لSPS. بعد رد فعل اقتران لالراتنج ، ويتم صرفها ببساطة الكواشف الزائدة وتغسل حبات ليكون جاهزا لاتخاذ الخطوة رد فعل المقبل. بعد رد فعل التجميع النهائي ، والمشقوق على كامل طول oligomers من الراتنج ويمكن دراسة المواد الحلول مرحلة أخرى. هنا ، علينا أن نكيف الداخلي الصحة والصحة النباتية لتوليد بوليمرات تسلسل محدد peptoid.
- ويمكن تنفيذ كل الخطوات من التوليف peptoid دليل أصل في البولي بروبيلين ، والقابل للتصرف (PP) خرطوشة fritted أو رد فعل الزجاج fritted السفينة مجهزة محبس 3 الطريقة : الإعداد. تنفيذ كافة العمليات في غطاء الدخان. لحضانات في زسفينة معشوقة أو خرطوشة من البلاستيك ، وربط ذراع واحدة لتوريد النيتروجين إلى فقاعة بلطف الحل السليم للخلط. بدلا من ذلك ، على سبيل رد الفعل في حضانات خرطوشة القابل للتصرف ، وختم كلا طرفي خرطوشة مع القبعات ومكان على شاكر الدوارة. لاستنزاف مخاليط رد فعل أو يغسل ، وصل الى منزل عن طريق فخ الفراغ النفايات. وينبغي fritted السفينة مع فريت الخشنة. Siliconize وعاء التفاعل لتفادي الزجاج حبات من الالتصاق على جدران الوعاء الزجاجي. يعد حل dichlorodimethylsilane 5 ٪ في ثنائي كلورو إيثان (V / V). ملء وعاء التفاعل نظيفة وجافة إلى أعلى مع الحل siliconizing ، اسمحوا الجلوس لمدة 30 دقائق ، ثم تصفى. غسل الإناء مرة واحدة مع DCE ومن ثم مرة واحدة مع الميثانول. يمكن إعادة استخدامها في حل siliconizing ، لذا يجب أن يتم حفظها. اما الهواء الجاف أو التخلص من أي حل الزائدة وأخبز الأواني الزجاجية حتى يجف بعد إزالة محبس. عاء التفاعل بارد قبل إضافة الراتنج.
- إضافة 100 ملغ (0.06 ملمول) من إعادة أميد التزلجالخطيئة لfritted عاء التفاعل. تنتفخ الراتنج بإضافة 2 مل من ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF). تستنهض الهمم عن طريق هز أو محتدما لمدة 10 دقيقة. حل عن طريق استنزاف فراغ لعزل راتنج تضخم.
- إضافة 1 مل من 20 ٪ في 4 methylpiperidine DMF (V / V) لdeprotect المجموعة Fmoc. تستنهض الهمم لمدة 2 دقيقة ويصفى. كرر مع احتضان 12 دقيقة.
- شطف راتنج بإضافة 2 مل من DMF ، تهييج لمدة 15 ثانية ، واستنزاف. كرر 3X.
- Bromoacetylation : إضافة 1 مل من حمض bromoacetic 0.6 م (0.6 ملمول) في DMF و 86 ميكرولتر من N ، N' - diisopropylcarbodiimide (0.93 مكافئ ، 0.56 ملمول). احتضان محتدما مع لطيفة لمدة 30 دقائق ، ثم تصفى وشطف مع 2 مل من DMF (اكرر 4X).
- الإزاحة : أضف 1 مل من الأمينات M 1-2 في N - methylpyrrolidinone. احتضان محتدما مع ل30-120 دقائق ، ثم تصفى وشطف مع DMF (4X 2 مل).
- تستمر في النمو سلسلة peptoid بتكرار دورة submonomer خطوات 1.5 (bromoacetylation) و 1.6 (displacemenر).
- بعد الانتهاء من النزوح النهائي ، شطف مع 2 مل من DMF (اكرر 4X) ، ثم 2 مل من ثنائي كلورو ميثان (اكرر 3X). قبعة وتخزينها في وعاء التفاعل حتى الانقسام.
- وقفة في التوليف (اختياري) : لإيقاف خلال توليفة peptoid ، والانتهاء من رد الفعل التشرد ومتابعة الخطوة 1.8. لمواصلة النمو في سلسلة peptoid ، أعد تشغيل التجميعي راتنج إعادة تورم المجففة (الخطوة 1.2) وتكرار دورة submonomer (الخطوة 1.5 و 1.6). يمكن أن تجفف الراتنج وتخزينها بعد أي النزوح والتشريد باستثناء 2 لأن المتقارن الراتنج peptoid قد تشكل الجانب ثنائي كيتوبيرازين دوري المنتج.
- لتوليفات متعددة في وقت واحد ، فمن المستحسن فراغ استخراج الصلبة المرحلة المتعددة لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة. ويمكن أيضا أن يكون توليف Peptoid الآلي عن طريق البرمجة بشكل صحيح الأساليب في تخليق الببتيد المتاحة تجاريا ، مثل أبيكس Aapptec 396 ، CEM المزج الميكروويف الحرية وتكنو البروتينlogies المزج تمهيدا شركة.
2. الانقسام وDeprotection الجانبية سلسلة
- نقل كل من راتنج المجفف إلى قارورة من الزجاج 20 مل التلألؤ.
- العمل داخل غطاء محرك السيارة ، واستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، إضافة 4 مل من حمض trifluoroacetic (TFA) كوكتيل تشطر 1 (على سبيل المثال 95 ٪ عبد القدير. TFA ، انظر المناقشة) إلى قارورة زجاجية التلألؤ وغطاء بإحكام. يهز لمدة 10 دقيقة الى 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (انظر المناقشة).
- جمع حل الانقسام TFA من خلال تصفية الراتنج خلال خرطوشة القابل للتصرف ، PP fritted في عالم جديد ، قبل وزنه 20 مل قنينة زجاجية التلألؤ. ويمكن التخلص منها ، PP ماصة غير مريحة لنقل الحلول كوكتيل الانقسام.
- إضافة 1 مل من الكوكتيل الطازجة الانقسام لشطف الراتنج وجمع أي peptoid المتبقية. كرر 2X.
- تتبخر TFA التي تهب تيار لطيف من النيتروجين أو باستخدام V10 Biotage المبخر.
- Redissolve النفط الخام في 6 ملمن أسيتونتريل / الماء 1:1 (V / V) لهبلك. تجميد وlyophilize. تكرار.
- سجل الوزن من الناتج الخام. مخزن على شكل مسحوق جاف في -20 درجة مئوية
- يمكن إجراء الاختبار على الانقسام 0.5 ٪ من الراتنج لتحديد سرعة ونقاء كتلة peptoid توليفها وعما إذا كانت ظروف الانقسام اختيار الصحيح : تشطر اختبار (اختياري). اختبار الانشقاقات هي مفيدة بشكل خاص لرصد التقدم المحرز في عملية التجميع.
3. توصيف وتنقية Polypeptoid
- من خلال مزيج من HPLC التحليلية ، MS - LC electrospray ، و / أو TOF MALDI ، تحديد نقاء المنتج الخام وعما إذا كان الوزن الجزيئي هو المطلوب حاليا.
- تعد ~ 50-10 ملغ / مل حل مسحوق جاف peptoid في المياه مع الحد الأدنى من أسيتونتريل حسب الحاجة للذوبان. الحل واضح تصفية من الناتج الخام peptoid مع 0.45 ميكرون تصفية حقنة لإزالة الغبار والجسيمات.
- التحليلية Hالمجلس التشريعي الفلسطيني وelectrospray LC - MS : إعداد ~ 20 ميكروغرام / مل حل peptoid الخام. تصفية 200 ميكرولتر مع 0.45 ميكرون تصفية وضخ 20 ميكرولتر.
- MALDI : اخلطي 1 ميكرولتر من peptoid ~ ملغ / مل 20 مع 1 ميكرولتر المصفوفة. البقعة 1 ميكرولتر على لوحة MALDI والسماح للهواء الجاف. ووضع مصفوفة الاستحواذ يعتمد على العينة (الشكل 5).
- تنقية مزيج النفط الخام peptoid مع HPLC الإعدادية عكس المرحلة. اختيار الانحدار والعمود (C4 أو C18) على أساس من hydrophobicity polypeptoid. الجمع بين تنقية الكسور ، وتجميد ، وlyophilize ، مما أسفر عن مسحوق أبيض رقيق. سجل وزن المنتج النهائي.
- تشكيل ملح حمض الهيدروكلوريك (اختياري) : Redissolve مسحوق مجفف بالتجميد في حمض الهيدروكلوريك 100 ملم (aq.) مع الحد الأدنى من الأسيتونيتريل. نقل إلى ما قبل وزنه قنينة زجاجية. تجميد وإعادة lyophilize. كرر 2X. Reweigh لتحديد كتلة من مسحوق peptoid.
4. Peptoid تشكيل Nanosheet
قصر هذا المقطعcribes بروتوكول لتشكيل ورقة من سلسلة واحدة ، وتسلسل ، amphiphilic محددة مير peptoid 36 (الشكل 1). بعد توليفها حبلا peptoid ، منقى ، ومجفف بالتجميد على النحو الموصوف أعلاه ، هو حل مسحوق أبيض في الناتج DMSO لجعل مخزون مم 2 الحل.
- إعداد 500 ميكروليتر من محلول 20 ميكرومتر في peptoid العازلة تشكيل ورقة (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0 في الماء) في قنينة زجاجية الدرام 1. الأولى ، إضافة 445 ميكرولتر من الملة - Q المياه ، و 50 ميكرولتر من 10X ورقة تشكيل العازلة ، ودوامة لالمزيج. ثم ، إضافة 5 ميكرولتر من 2 ملم peptoid حل الأسهم وحل دوامة بلطف. غطاء القارورة الزجاجية.
- تتكون من صفائح رقيقة من الهياج الحل peptoid مائي مخفف. تميل ببطء القارورة الزجاجية من الوضع الأفقي إلى الوضع العمودي في النتائج ورقة. لطيفة تهز الغلة أيضا ورقة ، ولكن الأوراق تميل إلى أن تكون أصغر حجما وأقل مع حواف مستقيمة. تحليل أكثر دقة ورقة وآلية تشكيل reporteد بشكل منفصل. 2
- لأوراق عالية الجودة كثيرة ، تدوير القوارير الزجاجية حول محور أفقي ببطء (<1 دورة في الدقيقة) لمدة ثلاثة أيام. RKVSD والموارد التقنية الملائمة Rotamix المدورة أنبوب أو الروك مخصصة يمكن أن تؤدي هذه بشكل مستمر.
- غسيل الكلى من Nanosheets (اختياري) : في بعض التطبيقات ، قد يكون من الضروري إزالة أي سلاسل حرة أو مخازن peptoid / الأملاح. بلل تعويم - A - Lyzer 100 دينار كويتي في الأغشية العازلة المطلوب لمدة 15 دقيقة. تحميل 500 ورقة peptoid ميكرولتر حل في غرفة العينة. نقع في 500 مل من المخزن المطلوب ، التحريك بقضيب تحريك مغناطيسي في 60 دورة في الدقيقة. تسمح غسيل الكلى من أوراق والمضي قدما لمدة 4 ساعات. كل ساعة ، وتبادل مع الأسهم الجديدة من حل العازلة.
5. مضان المجهر من Nanosheets
- وقد التقط صورا مضان من nanosheets مع الأحمر النيل ، وهي الصبغة الحساسة بيئيا التي تزيد كثافة مضان عندما يكون موضعيا في اللمفophobic البيئات (الشكل 2).
- إضافة 1 ميكرولتر من 100 ميكرومتر النيل الأحمر إلى 100 ميكروليتر من محلول nanosheet للحصول على تركيز النهائي من 1 ميكرومتر الأحمر النيل.
- جعل الحل agarose 1 ٪ من الماء الساخن ويسكب في طبق بتري بلاستيكية. ضمان حل agarose ما يقرب من 1 / 8 بوصة سميكة ويسمح الحل لتهدئة دون عائق على سطح مستو. بعد غروب agarose ، واستخدام ملعقة لخفض ونقل المربعات 1 سم x 1 سم إلى شريحة زجاجية.
- لجمع الأوراق في نفس الطائرة ، بقعة 1 ميكروليتر من محلول الورقة على قطعة من agarose. السماح لاستيعاب agarose العازلة لمدة 2 دقيقة ، وترك ورقة على السطح. صورة في غضون 15 دقيقة ، وإلا سوف تبدأ agarose لتشويه بسبب الجفاف.
- إلى أوراق الصور في الحل ، تحميل 15 ميكرولتر داخل طوقا قطره 20 ملم ملم 0.12 على شريحة زجاجية. تغطية مع ساترة. إذا كنت تقع ببساطة الأوراق بين شريحة زجاجية وساترة دون حشية ، العديد من أوراق وايوسوف القص وتبخر طفيفة على ما يبدو سبب لنقل الأوراق باستمرار.
- صورة ورقة تحت الإضاءة epifluorescence (مثلا IX81 أوليمبوس المجهر المقلوب مزودة iXonEM Andor + الأطياف EMCCD مع فلتر الحمراء ولاية تكساس).
6. المجهر الإلكتروني (SEM) من Nanosheets
- البلازما من حفر الركيزة السيليكون (اختياري) : إن رقائق السيليكون وحفرت البلازما للمساعدة في امتصاص الأوراق. وضع رقائق السيليكون في غرفة فراغ نظافة البلازما (مثل Harrick البلازما الأنظف / معقم PDC - 32G). مضخة أسفل إلى 200 mTorr وتعيين لفائف RF 18W (الإعداد عالية لPDC - 32G). حفر لمدة 2 دقيقة.
- بنسبة 20 ميكرولتر من محلول رقة peptoid على ركيزة السيليكون البلازما المعاملة. السماح للجلوس لمدة 3 دقائق. الحل إزالة الزائدة مع غيض من كيم مسح. ماصة 20 ميكروليتر من الماء على سطح وإزالة الزائد الحل مرة أخرى لإزالة العازلة والأملاح. كرر 4X.
- بدلا من ذلك ، اطلبyze الحلول رقة peptoid ضد الماء لإزالة العازلة والملح. بنسبة 20 ميكرولتر من محلول رقة مدال على ركائز السيليكون البلازما المعاملة. الهواء الجاف العينة.
- صورة ورقة مع SEM (مثل زايس الجوزاء الترا - 55 الكترون مجهر المسح التحليلي) مع كاشف في عدسة والحزم في الطاقات بين 1 كيلو فولت و 5 كيلو فولت (الشكل 3).
7. سلامة ملاحظات :
- ويشتبه بشكل معقول وثنائي ميثيل ثنائي كلورو ميثان المسرطنة.
- N ، N' Diisopropylcarbodiimide ، 4 methylpiperdine وحمض bromoacetic تشكل خطرا على الجلد والعينين والجهاز التنفسي. وينبغي استخدامها في غطاء محرك السيارة بعناية. قد تكون سامة إذا تم استنشاقها أو امتصاصها عن طريق الجلد ، والتعرض قد يؤدي في التوعية. الحاويات الفارغة تحتفظ بقايا المنتج (السائل / بخار) ، وينبغي أن تشطف جيدا قبل إزالتها من غطاء محرك السيارة.
- TFA هو حمض قوي ومدمر للغاية على الجهاز التنفسي العلوي والعينين ، والجلد. TFA أيضا المتطايرة إبقاء حلول مركزة من TFA في غطاء المحرك في جميع الأوقات لتجنب الضرر التنفسي. استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، والحذر عند التعامل مع حلول TFA. تغيير القفازات على الفور إذا كانت تأتي في اتصال مع TFA ، وتنظيف أي انسكابات فورا.
8. ممثل النتائج :
هذا المقطع يصف التوليف ، وتوصيف ، وتنقية تسلسل محدد سلسلة peptoid 36 مير أن تطوي إلى nanosheet أمر غاية 3 (الشكل 1).
كتلة المسؤول peptoid H - [ناي - NPE] 9 -- تم تصنيعه [NCE - NPE] 9 - NH 2 على 100 ملغ من راتنج أميد حلبة التزلج. واستخدمت حل الأمينات 2 M لجميع ردود الفعل التشرد ، والتي نفذت لمدة 60 دقيقة بحثا عن بقايا 1-18 و 120 دقيقة لبقايا 19-36. تم تحويل ر بوتيل بيتا ألانين حمض الهيدروكلوريك إلى قاعدة الحرة (انظر المناقشة) في حين الفينيثيلامين والإيثيلنديامين BOC - كانا directl المستخدمةY. وكان المشقوق الراتنج مع TFA 95 ٪ ، triispropylsilane 2.5 ٪ ، 2.5 ٪ ماء لمدة 2 ساعة. وقد تبخرت TFA وكان النفط اللزج الناتجة (~ 180 ملغ) إعادة حله في أسيتونتريل مل 6 : الماء 1:1 (V / V). وتم تأكيد نقاء المنتج (الشكل 4) وجود كتلة من المنتج بواسطة RP - HPLC التحليلية (30-80 ٪ في الانحدار أسيتونتريل المياه ، سواء التي تحتوي على 0.1 ٪ (V / V) TFA ، في 1 مل / دقيقة أكثر من 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية مع ميكرومتر C18 5 ، و 50 مم X العمود 2) وMALDI (الشكل 5).
وشرع مع تنقية HPLC المرحلة العكسي على عمود C18 Vydac (10 ميكرون و 22 ملم x 250 ملم) ، وذلك باستخدام الانحدار 30-60 ٪ من أسيتونتريل في الماء مع TFA 0.1 ٪ على مدى 60 دقيقة في 10 مل / دقيقة. تم تحميل العمود مع 60 ملغ من الناتج الخام لتشغيل كل الكروماتوغرافي. تم الجمع بين الكسور تنقيتها على أساس من النقاء RP - HPLC التحليلية (الشكل 4) ، ومجفف بالتجميد لانتاج ~ 80 ملغ من مسحوق أبيض رقيق.
تنقية كتلة المسؤول peptoid الجزيئيةوأكد الوزن عن طريق MALDI. كانت مختلطة الماء 1:1 (V / V) مع 1 ميكرولتر من مصفوفة (5 ملغ / مل α - cyano - 4 - hydroxycinnamic الحمضية في أسيتونتريل : : 1 ميكرولتر من 100 ميكرومتر تنقية المياه peptoid في أسيتونتريل 01:01 V / V و وقد رصدت 0.1 ٪ TFA) وميكرولتر 1 على لوحة MALDI. بعد العينة المجفف في الهواء ، وضعه في Biosystem التطبيقية / MDS 4800 SCIEX محلل TOF / TOF MALDI. وكانت وسائل اقتناء وتجهيز انخفاض الكتلة الخطية. تم إدخال الوزن محسوب في الكتلة المستهدفة لضبط تلقائيا للمرة تأخير. تم تعيين كثافة الليزر إلى 3400. الكتلة المرصودة ، 4981.2 ، المباريات عن كثب لكتلة المحسوب 4981.74.
حلت مسحوق مجفف بالتجميد المنقى في DMSO لجعل مخزون مم 2 الحل ، والتي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية. وأعدت ورقة عن طريق البروتوكول المشار إليها ، والتقط مع المجهر الضوئي ومضان SEM (الشكل رقم 2 و 3). ويلاحظ ومجموعة متنوعة من الأشكال مع أحجام ميزة تتراوح ما يصل إلى 300 ميكرون ، وnotabلاي والحواف المستقيمة بارزة.
الشكل 1 تسلسل كتلة المسؤول peptoid H - [ناي - NPE] 9 -- [NCE - NPE] NH - 9 2. سلسلة واحدة ، تهمة عرقلة ، polypeptoid amphiphilic 36 ميه الذاتي في تجمع عالي أمر nanosheets ثنائي الأبعاد ، 3. الوزن الجزيئي هو محسوب 4981.74.
الشكل 2. الصور المجهري الإسفار من nanosheets peptoid. وقد تشكلت من أوراق الحل peptoid 20 ميكرون في تريس 10 مم ، 100 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0. تم تصوير الأوراق على agarose مع 1μM النيل الأحمر. أشرطة النطاق هي 100 ميكرون.
الشكل 3. مسح الصور الإلكترون المجهريمن nanosheets peptoid. وقد تشكلت من أوراق الحل peptoid 20 ميكرون في تريس 10 مم ، 100 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0. أشرطة النطاق هي 5 ميكرون.
الشكل 4 التحليلية عكس المرحلة HPLC اثر H - [ناي - NPE] 9 -- [NCE - NPE] NH - 9 2. النفط الخام وتنقيته HPLC التحليلية التتبع (30-80 ٪ التدرج في 1 مل / دقيقة أكثر من 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية مع ميكرومتر C18 5 ، 50 × العمود مم 2) من النفط الخام وتنقيته كتلة المسؤول peptoid H - [ يظهر [NCE - NPE] 9 - NH 2 -- دار الوثائق NPE - 9].
الشكل 5 - TOF MALDI مطياف الكتلة اثر H - [ناي - NPE] 9 -- [NCE - NPE] NH - 9 2. الكتلة المرصودة ، 4981.2 ، في الاتفاق على مقربة من الكتلة المحسوبة ، 4981،74.
Discussion
وأهمية التطبيقات
يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لتجميع وpeptoid مائي التجميع الذاتي للpeptoids في nanosheets. معظم المختبرات قادرة بسهولة من تجميع peptoids لأن المواد الرخيصة ، والخبرات والتقنيات الأساسية واضحة وتستخدم 4. وبالمثل ، فإن التجميع الذاتي للرقيقة جدا nanosheets العالية أمر يتطلب مجرد تكرار إمالة قارورة حل peptoid مائي مخفف 2. Peptoids هي مادة واعدة للبحوث الطبية البيولوجية وعلم النانو لأنها قوية ومرنة صناعيا بعد تسلسل محدد والانضباطي للغاية 5. وقد أثبتت Peptoids النشاط البيولوجي (6،7 المداواة ، والتشخيص 8 ، والتسليم بين الخلايا 9-10) وقابلة للطي في النانو الهرمية 3 ، 11-14. بسبب التركيب على وحدات ، واندماجي peptoid librويمكن تصنيعه بسهولة 15-19 الحمل وفرزهم لسلسلة واسعة من الأنشطة أو الممتلكات. على وجه الخصوص ، nanosheets بمثابة منصة المحتملة لعرض السقالات ثنائي الأبعاد ، mimetics الغشاء ، وأجهزة الاستشعار البيولوجية ، وتصنيع البروتين mimetics الجهاز. مع تسلسل مختلف ممكن عمليا لا ينضب ، عالم الأبحاث peptoid تتوسع بسرعة.
المتغيرات في التوليف submonomer الصلبة مرحلة polypeptoids
لأن القدرة على اختيار من لا يصدق أبجدية كبيرة ومتنوعة من مونومرات 20 ، الأسلوب submonomer يحتاج تعديلات في بعض الأحيان عن الحالات التي تكون فيها زيادة كفاءة اقتران كل خطوة من شأنها تحسين العائد الناتج الكلي. ادراج محمية سلاسل الجانب متجانسة يتطلب استخدام حمض الكلوروأسيتيك بدلا من حمض bromoacetic 21. تمديد أوقات التشرد والتعليم العاليوتستخدم عادة تركيزات الأمينات بعد حوالي 20 جوانات لمتواليات peptoid طويلة أو الأمينات أقل أليف النواة. تسخين وعاء التفاعل إلى 35 درجة مئوية ، وذلك باستخدام سفينة رد فعل المياه تغلف ، ويساعد على دفع التفاعل. لدرجة عالية من الأمينات المتقلبة مثل isopropylamine ، لا بد من توخي الحذر لتجنب التبخر.
الأمينات في شكل ملح حمض الهيدروكلوريك ، مثل حمض الهيدروكلوريك بيتا ألانين تي بوتيل ، والحاجة ليكون حرا مقرها قبل أن يتم عرضه في رد فعل التشرد. ويمكن تحقيق هذا عن طريق إذابة أو تعليق أمين في DCM (~ 5G amine/25 مل DCM) ، وتحييد بمحلول متساوي المولية من هيدروكسيد الصوديوم المائي في قمع separatory. ويتم جمع طبقة DCM ويغسل طبقة مائية مع DCM إضافية. تجفف طبقات DCM مجتمعة أكثر من كبريتات الصوديوم وتصفيتها في أسفل القارورة الجولة ما قبل وزنه. إزالة المذيب عن طريق التبخر دوارة لتسفر عن النفط ، وتسجيل وزن المنتج.
الزيتوز الخطوة الانقسام ، TFA كوكتيل الانقسام والانقسام الوقت يعتمد على عدد ومتنوعة لحماية الفئات المستخدمة. المبادئ التوجيهية للكوكتيلات تشطر تتشابه الانقسامات التقليدية deprotection الببتيد 1. عموما ، هناك حاجة الدقيقة 10 حضانات لمتواليات من دون حماية أو الجماعات أو متواليات مع عدد قليل من الجماعات عطوب حمض حماية عالية (مثل BOC ، trityl). وأوصى اثنين من حضانات ساعة لمتواليات أكثر صعوبة مع جماعات حماية (على سبيل المثال تي بوتيل استر ، MTR ، PBF) أو متواليات مع العديد من الجماعات لضمان حماية كاملة من كل deprotection السلسلة. والمنتجات الخام peptoid حل عموما في أسيتونتريل : 1:1 المياه (V / V) ، ولكن بنسب أعلى أسيتونتريل هي مشتركة مع سلاسل جنب مع hydrophobicity شامل عالية.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر لي بيونغ تشول ، تشوي هو صموئيل وفيليب لمساعدة قيمة. ونفذ هذا العمل في مسبك الجزيئية في مختبر لورانس بيركلي الوطني ، وهو مدعوم من قبل مكتب المفوضية ، والعلوم العلوم الأساسية للطاقة ، من وزارة الطاقة الأميركية بموجب العقد رقم DE - AC02 - 05CH11231 وزير الدفاع للحد من التهديد الوكالة تحت رقم العقد : IACRO - B0845281.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylformamide | EMD Millipore | EM-DX1726P-1 | 99+% |
| N-methylpyrrolidinone | VWR | BDH1141-4LP | 99% |
| Bromoacetic Acid | Acros Organics | 200000-106 | 99% |
| 4-Methylpiperidine | Sigma-Aldrich | M73206 | 96% |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International | 001100 | 99.5% |
| Dichloromethane | EMD Millipore | EMD-DX0835 | ACS grade |
| Acetonitrile | EMD Millipore | EM-AX0145P-1 | 99.8% |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | 99% |
| Triisopropylsilane | Sigma-Aldrich | 233781-10G | For TFA cleavage |
| 1,2-Dichlor–thane | JT Baker | JTH076-33 | For siliconization of glass reaction vessels |
| Phenethylamine | Sigma-Aldrich | 407267-100ML | >99.5% Hydrophobic side-chain amine |
| Boc-ethylenediamine | CNH Technologies | C-1112 | Cationic side-chain amine |
| t-Butyl beta-alanine HCl | Chem-Impex International | 04407 | Anionic side-chain amine |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C8982-10X10MG | For MALDI matrix |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 19123-10MG | For fluorescence Imaging |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 80430-500G-F | For siliconization of glass reaction vessels |
| Disposable PP fritted cartridge | Applied Separations | 2416 | 6 mL polypropylene cartridge with 20 mm PE frit |
| Disposable 3 way luer adapter | Cole-Parmer | 31200-80 | Stopcock for disposable manual synthesis reaction vessel |
| Luer Lock ring | Cole-Parmer | 45503-19 | 1/4" fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
| Fittings Luer | Cole-Parmer | 45500-20 | 1/4" fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
| Disposable PP pipets | VWR international | 16001-194 | For TFA transfers |
| Luer lock plastic syringe | National Scientific | S7515-5 | 6 mL syringes |
| 1 dram glass vial | VWR international | 66011-041 | With phenolic molded screw cap with polyvinyl-faced pulp liner |
| 20 mL scintillation vial | VWR international | 66022-060 | With attached PP cap and pulp foil liner |
| Secure-Seal adhesive spacer | Invitrogen | S-24736 | For fluorescence imaging |
| Glass slides | Electron Microscopy Sciences | 63411 | For fluorescence imaging |
| Cover slip | VWR international | 48366-067 | For fluorescence imaging |
| 4” Silicon wafer | Ted Pella, Inc. | 16007 | Pre-dice in 5x7 mm chips |
| 0.45 filter | VWR international | 28143-924 | For HPLC. PTFE membrane |
| Agarose | BD Biosciences | 212272 | For fluorescence imaging |
| SPE Vacuum Manifold | Sigma-Aldrich | 57044 | Example of SPE vacuum manifold |
| Fritted glass vessel | Ace glass | 6402-12 | Porosity C frit |
| Plasma Cleaner/Sterilizer | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | Example of plasma cleaner to prepare silicon chips for SEM |
References
- King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Pro. Res. 36, 255-266 (1990).
- Sanii, B., Kudirka, R., Cho, A., Venkateswaran, N., Oliver, G. K., Olson, A. M., Tran, H., Harada, R. M., Tan, L., Zuckermann, R. N. Shaken, not stirred: Collapsing a peptoid monolayer to produce free-floating, stable nanosheets. J. Am. Chem. Soc. , (2011).
- Kudirka, R., Tran, H., Sanii, B., Nam, K. T., Choi, P. H., Venkateswaran, N., Chen, R., Whitelam, S., Zuckermann, R. N. Folding of a single-chain, information-rich polypeptoid sequence into a highly-ordered nanosheet. Bioploymers: Peptide Science. 96, 586-595 (2011).
- Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Zuckermann, R., Pohl, N., Kirshenbaum, K. Rapid multistep synthesis of a bioactive peptidomimetic oligomer for the undergraduate laboratory. J. Chem. Ed. 87, 637-639 (2010).
- Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7, 1508-1524 (2009).
- Zuckermann, R. N., Kodadek, T. Peptoids as potential therapeutics. Curr. Op. Mol. Ther. 11, 299-307 (2009).
- Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function and mechanism of helical antimicrobial peptides. , 105-2794 (2008).
- Yam, A. Y., Wang, X., Gao, C., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Bleua, T., Halla, J., Fedynyshyn, J., Allauzen, S., Peretz, D., Salisbury, C. M. A Universal method for detection of amyloidogenic misfolded proteins. Biochem. 50, 4322-4329 (2011).
- Huang, C. -Y., Uno, T., Murphy, J. E., Lee, S., Hamer, J. D., Escobedo, J. A., Cohen, F. E., Radhakrishnan, R., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. Lipitoids - novel cationic lipids for cellular delivery of plasmid DNA in vitro. Chem. Biol. 5, 345-354 (1998).
- Schroeder, T., Niemeier, N., Afonin, S., Ulrich, A. S., Krug, H. F., Bräse, S. Peptoidic amino- and guanidinium-carrier systems: Targeted drug delivery into the cell cytosol or the nucleus. J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).
- Murnen, H. K., Rosales, A. M., Jaworski, J. N., Segalman, R. A., Zuckermann, R. N. Hierarchical self-assembly of a biomimetic diblock copolypeptoid into homochiral super helices. J. Am. Chem. Soc. 132, 16112-16119 (2010).
- Nam, K. T., Shelby, S. A., Marciel, A. B., Choi, P. H., Chen, R., Tan, L., Chu, T. K. Free-floating ultra-thin two-dimensional crystals from sequence-specific peptoid polymers. Nature. Mater. 9, 454-460 (2010).
- Burkoth, T. S., Beausoleil, E., Kaur, S., Tang, D., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N. Toward the synthesis of artificial proteins: The Discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly. Chemistry & Biology. 9, 647-654 (2002).
- Murphy, J. E., Uno, T., Hamer, J. D., Cohen, F. E., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. A Combinatorial approach to the discovery of efficient cationic peptoid reagents for gene delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 1517-1522 (1998).
- Mora, P. uig, Masip, I. sabel, Cortés, N. uria, Marquina, R. egina, Merino, R. amón, Merino, J. esús, Carbonell, T. eresa, Mingarro, I. smael, Messeguer, A. ngel, Pérez-Payá, E. nrique Identification from a positional scanning peptoid library of in vivo active compounds that neutralize bacterial endotoxins. J. Med. Chem. 48, 1265-1268 (2005).
- Zuckermann, R. N. Discovery of nanomolar ligands for 7-transmembrane G-protein coupled receptors from a diverse (N-substituted)glycine peptoid Library. J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994).
- Alluri, P., Liu, B., Yu, P., Xiao, X., Kodadek, T. Isolation and characterization of coactivator-binding peptoids from a combinatorial library. Moleular Biosystems. 2, 568-579 (2006).
- Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-(substituted)glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
- Culf, A. S., Ouellette, R. J. Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (α peptoids) and derivatives. Molecules. 15, 5282-5335 (2010).
- Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis. J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).
