En enkel og generell manuell peptoid syntese metoden involverer basisutstyr og kommersielt tilgjengelige reagenser er skissert, slik at peptoids å være lett syntetiseres i de fleste laboratorier. Syntese, rensing og karakterisering av en amfifile peptoid 36mer er beskrevet, samt dens selv-montering i svært bestilt nanosheets.
Peptoids er en ny klasse av biomimetic, ikke-naturlige, sekvens-spesifikke heteropolymers som motstår proteolyse, utstillingsområde potent biologisk aktivitet, og vend inn i høyere orden nanostrukturer. Strukturelt lik peptider, peptoids er poly N-substituerte Glycines, der sidekjeder er festet til nitrogen enn alfa-karbon. Deres lette syntese og strukturelle mangfoldet gjør testing av grunnleggende design prinsipper for å drive de novo design og prosjektering av nye biologisk aktive og nanostrukturerte materialer.
Her er en enkel manuell peptoid syntese protokoll presenterte som gjør at syntesen av langkjedete polypeptoids (opptil 50mers) i utmerket avkastning. Kun grunnleggende utstyr, enkle teknikker (f.eks flytende transfer, filtrering) og kommersielt tilgjengelig reagenser er nødvendig, noe som gjør peptoids et tilgjengelig tillegg til mange forskere 'verktøysett. Den peptoid backbone er dyrket en monomer gangen vbl.a. submonomer metode som består av en to-trinns monomer tillegg syklus: acylation og forskyvning. Først bromoacetic syre aktivert in situ med N, acylates N'-diisopropylcarbodiimide en harpiks-bundet sekundære amin. Sekund, nucleophilic forskyvning av bromide ved en primær amin følger å introdusere siden kjeden. De to-trinns syklus er iterated til ønsket kjedelengden er nådd. Koblingen effektiviteten av denne to-trinns syklus overstiger rutinemessig 98% og gjør syntesen av peptoids så lenge som 50 rester. Meget tunbare, presis og kjemisk diverse sekvenser er oppnåelig med submonomer metoden som hundrevis av lett tilgjengelige primære aminer kan være direkte innarbeidet.
Peptoids er fremstår som en allsidig biomimetic materiale for nanobioscience forskning på grunn av deres syntetiske fleksibilitet, robusthet, og bestilling på atomnivå. Folding av en enkelt-kjede, amfifile, informasjon-rik polypeptoid inn i en svært bestilte nanosheet ble nylig demonstrert. Dette peptoid er en 36-mer som består av bare tre forskjellige kommersielt tilgjengelige monomerer: hydrofobe, kationiske og anioniske. Den hydrofobe Phenylethyl sidekjeder er gravlagt i nanosheet kjernen mens ionisk amin og carboxyl sidekjeder justere på hydrofile ansikter. Den peptoid nanosheets tjene som en potensiell plattform for membran mimetics, protein mimetics, enhet fabrikasjon, og sensorer. Metoder for peptoid syntese, ark formasjon, og mikroskopi bildebehandling er beskrevet og gir en enkel metode for å muliggjøre fremtidig peptoid nanosheet design.
Søknader og betydning
Denne protokollen beskriver en enkel og effektiv metode for peptoid syntese og vannholdige selv-montering av peptoids inn nanosheets. De fleste laboratorier er lett stand til å syntetisere peptoids fordi billige materialer, grunnleggende kompetanse og enkle teknikker er utnyttet fire. Likeledes krever selv-montering av ultra-tynn, svært bestilte nanosheets bare gjentatt tilting et hetteglass med en fortynnet vandig peptoid løsning 2. Peptoids er lovende materiale for biomedisinsk og nanovitenskap forskning fordi de er robuste og synthetically fleksibel ennå sekvens-spesifikke og svært tunbare 5. Peptoids har vist biologisk aktivitet (legemiddelselskap 6,7, diagnostikk 8, intracellulære levering 9-10) og folde inn hierarkiske nanostrukturer 3, 11-14. På grunn av sin modulære syntese, kombinatorisk peptoid librVæren 15-19 kan lett syntetiseres og screenes for en bred serie av aktiviteter eller eiendom. Spesielt nanosheets tjene som en potensiell plattform for to-dimensjonal visning stillasene, membran mimetics, biologiske sensorer, protein mimetics og enhet fabrikasjon. Med praktisk talt uuttømmelige forskjellige sekvenser mulig, er rike peptoid forskning raskt ekspanderende.
Variabler i fast-fase submonomer syntese av polypeptoids
På grunn av muligheten til å velge fra en utrolig stor og mangfoldig alfabet av monomerer 20, må submonomer metode sporadiske modifikasjoner for tilfeller hvor øke koblingen effektiviteten av hvert trinn vil forbedre den totale produktet yield. Inkorporering av ubeskyttet heterosykliske sidekjeder krever bruk av chloroacetic syre i stedet for bromoacetic syre 21. Utvidet displacement ganger og høyereamin konsentrasjoner er vanligvis ansatt etter ca 20 koplinger for lang peptoid sekvenser eller mindre nucleophilic aminer. Oppvarming reaksjonen fartøy til 35 ° C, ved hjelp av en vann-Jacketed reaksjon fartøy, bidrar til å drive reaksjonen. For svært flyktige aminer som isopropylamine, må man sørge for å unngå fordampning.
Aminer i form av en HCl salt, som for eksempel t-butyl beta-alanin HCl, må være fri-baserte før de blir introdusert i flukt reaksjon. Dette kan oppnås ved å løse eller opphenging av amin i DCM (~ 5g amine/25 ml DCM), og nøytralisere med en ekvimolare løsning av vandig natriumhydroksid i en skilletrakt. Den DCM laget er samlet og vandig laget er vasket med ekstra DCM. Den kombinerte DCM lagene er tørket i løpet natriumsulfat og filtrert inn i en pre-veid rund bunn kolbe. Fjern løsemiddel med roterende fordampning å gi en olje, og registrere produktet vekt.
Durinsg spalting trinn, TFA spalting cocktail og cleavage tid er avhengig av antall og variasjon av beskytte grupper brukes. Retningslinjer for cleavage cocktails ligner på tradisjonelle peptid deprotection splittelsene 1. Vanligvis er 10 minutter inkubasjoner kreves for sekvenser uten å beskytte grupper eller sekvenser med få svært syrelabil beskytte grupper (f.eks BOC, trityl). To timers inkubasjoner er anbefalt for sekvenser med vanskeligere beskytte grupper (f.eks t-butyl ester, Mtr, PBF) eller sekvenser med mange beskytte grupper for å sikre full deprotection av hver kjede. Crude peptoid produkter vil vanligvis løse seg opp i acetonitril: vann 1:1 (v / v), men høyere acetonitril proporsjonene er felles med sidekjeder med høyt generelt hydrofobisitet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Byoung-Chul Lee, Philip Choi og Samuel Ho for verdifull assistanse. Dette arbeidet ble utført ved Molekylær Foundry ved Lawrence Berkeley National Laboratory, som er støttet av Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, av US Department of Energy under kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231 og Defense Threat Reduction etat under Contract No: IACRO-B0845281.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Dimethylformamide | EMD | EM-DX1726P-1 | 99+% |
N-methylpyrrolidinone | BDH | BDH1141-4LP | 99% |
Bromoacetic Acid | Acros Organics | 200000-106 | 99% |
4-Methylpiperidine | Sigma Aldrich | M73206 | 96% |
N,N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex | 001100 | 99.5% |
Dichloromethane | EMD | EMD-DX0835 | ACS grade |
Acetonitrile | EMD | EM-AX0145P-1 | 99.8% |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | T6508 | 99% |
Triisopropylsilane | Sigma Aldrich | 233781-10G | For TFA cleavage |
1,2-Dichloroethane | JT Baker | JTH076-33 | For siliconization of glass reaction vessels |
Phenethylamine | Sigma Aldrich | 407267-100ML | >99.5% Hydrophobic side-chain amine |
Boc-ethylenediamine | CNH Technologies | C-1112 | Cationic side-chain amine |
t-Butyl beta-alanine HCl | Chem-Impex International | 04407 | Anionic side-chain amine |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | C8982-10X10MG | For MALDI matrix |
Nile Red | Sigma Aldrich | 19123-10MG | For fluorescence Imaging |
Dichlorodimethylsilane | Sigma Aldrich | 80430-500G-F | For siliconization of glass reaction vessels |
Disposable PP fritted cartridge | Applied Separations | 2416 | 6 mL polypropylene cartridge with 20 mm PE frit |
Disposable 3 way luer adapter | Cole Parmer | 31200-80 | Stopcock for disposable manual synthesis reaction vessel |
Luer Lock ring | Cole Parmer | 45503-19 | ¼” fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
Fittings Luer | Cole Parmer | 45500-20 | ¼” fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
Disposable PP pipets | VWR | 16001-194 | For TFA transfers |
Luer lock plastic syringe | National Scientific | S7515-5 | 6 mL syringes |
1 dram glass vial | VWR | 66011-041 | With phenolic molded screw cap with polyvinyl-faced pulp liner |
20 mL scintillation vial | VWR | 66022-060 | With attached PP cap and pulp foil liner |
Secure-Seal adhesive spacer | Invitrogen | S-24736 | For fluorescence imaging |
Glass slides | Electron Microscopy Sciences | 63411 | For fluorescence imaging |
Cover slip | VWR | 48366-067 | For fluorescence imaging |
4” Silicon wafer | Ted Pella | 16007 | Pre-dice in 5×7 mm chips |
0.45 filter | VWR, Acrodisc | 28143-924 | For HPLC. PTFE membrane |
Agarose | BD | 212272 | For fluorescence imaging |
SPE Vacuum Manifold | Sigma Aldrich | 57044 | Example of SPE vacuum manifold |
Fritted glass vessel | Ace glass | 6402-12 | Porosity C frit |
Plasma Cleaner/Sterilizer | Harrick Plasma | PDC-32G | Example of plasma cleaner to prepare silicon chips for SEM |