En enkel och allmänna handboken peptoid syntes metod med basutrustning och kommersiellt tillgängliga reagenser beskrivs, vilket gör peptoids att vara lätt syntetiseras i de flesta laboratorier. Det syntes, rening och karaktärisering av en amfifila peptoid 36mer beskrivs, liksom dess självorganisering i högt beställt nanosheets.
Peptoids är en ny klass av biomimetiska, icke-naturliga, sekvensspecifika heteropolymers som motstår proteolys, uppvisar stark biologisk aktivitet, och vänd ner högre ordning nanostrukturer. Strukturellt liknande peptider, peptoids är poly N-substituerade Glycines, där sidokedjorna är knutna till kväve snarare än alfa-kolet. Deras enkel syntes och strukturella mångfald kan testa grundläggande konstruktionsprinciper för att driva de novo design och konstruktion av nya biologiskt aktiva och nanostrukturerade material.
Här är en enkel manuell peptoid syntes protokoll presenteras som gör syntesen av långa kedjan polypeptoids (upp till 50mers) i utmärkt avkastning. Endast basutrustning, enkla tekniker (t.ex. vätsketransport, filtrering) och kommersiellt tillgängliga reagenser som krävs, vilket gör peptoids ett tillgängligt komplement till många forskare "verktygslådor. Den peptoid ryggraden odlas en monomer i taget motbl.a. submonomer metod som består av två steg monomer Förutom cykel: Acylation och fördrivning. Först bromoacetic Syraaktiverad in situ med N, acylates N'-diisopropylcarbodiimide ett harts-bundna sekundär amin. För det andra nukleofila förskjutning av bromid av en primär amin följer att införa sidokedjan. De två steg cykel upprepas tills önskad kedjan är nådd. Kopplingen effektiviteten i denna två steg cykel överstiger rutinmässigt 98% och möjliggör syntes av peptoids så länge som 50 rester. Mycket avstämbara, exakt och kemiskt olika sekvenser kan uppnås med submonomer metod som hundratals lättillgängliga primära aminer direkt kan införlivas.
Peptoids växer fram som en mångsidig biomimetiska material för nanobioscience forskning på grund av deras syntetiska flexibilitet, robusthet, och beställa på atomär nivå. Vikningen av en enda kedja, amfifila, informationtion-rika polypeptoid till ett högt beställt nanosheet har nyligen påvisats. Detta peptoid är en 36-Mer som består av endast tre olika kommersiellt tillgängliga monomererna hydrofoba, katjoniska och anjoniska. Den hydrofoba fenyletyl sidokedjorna är begravda i nanosheet kärnan medan de joniska amin och karboxylgrupper sidokedjor anpassa den hydrofila ansikten. Den peptoid nanosheets fungera som en potentiell plattform för membran mimetika, mimetika protein, Komponentframställning, och sensorer. Metoder för peptoid syntes, plåt bildning och mikroskopi avbildning beskrivs och ger en enkel metod för att möjliggöra framtida konstruktioner peptoid nanosheet.
Program och betydelse
Detta protokoll beskriver en enkel och effektiv metod för peptoid syntes och vattenfasen självorganisering av peptoids i nanosheets. De flesta laboratorier lätt kan syntetisera peptoids eftersom billiga material, grundläggande kompetens och enkla tekniker som används 4. Likaså kräver självorganisering av ultra-tunna, högt beställt nanosheets bara upprepade luta en injektionsflaska med en utspädd vattenlösning peptoid lösning 2. Peptoids är lovande material för biomedicinsk och nanovetenskap forskning eftersom de är robusta och syntetiskt flexibla ändå sekvensspecifika och mycket avstämbara 5. Peptoids har visat biologisk aktivitet (Therapeutics 6,7, diagnostik 8, intracellulär leverans 9-10) och vikning i hierarkiska nanostrukturer 3, 11-14. På grund av sin modulära syntes, kombinatoriska peptoid LiBrVädur 15-19 lätt kan syntetiseras och screenas för en bred rad aktiviteter eller egenskaper. I synnerhet nanosheets fungera som en potentiell plattform för tvådimensionell skärm ställningar, mimetika membran, biologiska sensorer, mimetika protein och Komponentframställning. Med praktiskt taget outtömliga olika sekvenser möjligt är rike peptoid forskning expanderar snabbt.
Variabler i fast fas submonomer syntes av polypeptoids
På grund av möjligheten att välja från en otroligt stor och varierande alfabet monomerer 20 behöver submonomer metoden enstaka ändringar i de fall där öka kopplingen effektiviteten i varje steg kommer att förbättra den totala produkten avkastning. Införande av oskyddade kedjor heterocykliska sida kräver användning av klorättiksyra istället för bromoacetic sura 21. Utökad deplacement och högreamin koncentrationer är vanligen anställda efter ca 20 kopplingar för långa peptoid sekvenser eller mindre nukleofila aminer. Värme reaktionskärlet till 35 ° C, med hjälp av en vattenmantlad reaktionskärl, hjälper till att driva reaktionen. För högt flyktiga aminer som Isopropylaminsalt, måste man vara försiktig för att undvika avdunstning.
Aminer i form av en klorid, såsom T-butyl beta-alanin HCl, måste vara fri-baserade innan de introduceras i förskjutning reaktionen. Detta kan uppnås genom att lösa upp eller avbryta amin i DCM (~ 5g amine/25 mL DCM) och neutralisera med en ekvimolära lösning av natriumhydroxid i en separationstratt. DCM lagret samlas in och vattenskiktet tvättas med ytterligare DCM. Den kombinerade DCM lagren torkas över natriumsulfat och filtreras i en pre-vägs rund botten kolv. Avlägsna lösningsmedlet från Rotary avdunstning ge en olja, och notera produktens vikt.
During klyvning steget, TFA klyvning cocktail och klyvning tiden är beroende på antal olika skydd används grupper. Riktlinjer för klyvning cocktails liknar traditionella klyftor peptid deprotection 1. Generellt är 10 minuters inkubationer krävs för sekvenser utan att skydda grupper eller sekvenser med få mycket syralabilt skydda grupper (t.ex. BOC trityl). Två timmars inkubationer rekommenderas för sekvenser med svårare skydda grupper (exempelvis t-butyl-ester, MTR, PBF) eller sekvenser med många skydda grupper för att säkerställa full deprotection i varje kedja. Råolja peptoid produkter kommer i allmänhet att lösas upp i acetonitril: vatten 1:1 (v / v), men högre andelar acetonitril är vanligt med sidokedjor med en hög total hydrofobicitet.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Byoung-Chul Lee, Philip Choi och Samuel Ho för värdefull hjälp. Detta arbete utfördes på molekylär Gjuteri vid Lawrence Berkeley National Laboratory, som stöds av Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, av US Department of Energy i Kontrakt nr DE-AC02-05CH11231 och Defense Threat Reduction byrån enligt avtal nr: IACRO-B0845281.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Dimethylformamide | EMD | EM-DX1726P-1 | 99+% |
N-methylpyrrolidinone | BDH | BDH1141-4LP | 99% |
Bromoacetic Acid | Acros Organics | 200000-106 | 99% |
4-Methylpiperidine | Sigma Aldrich | M73206 | 96% |
N,N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex | 001100 | 99.5% |
Dichloromethane | EMD | EMD-DX0835 | ACS grade |
Acetonitrile | EMD | EM-AX0145P-1 | 99.8% |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | T6508 | 99% |
Triisopropylsilane | Sigma Aldrich | 233781-10G | For TFA cleavage |
1,2-Dichloroethane | JT Baker | JTH076-33 | For siliconization of glass reaction vessels |
Phenethylamine | Sigma Aldrich | 407267-100ML | >99.5% Hydrophobic side-chain amine |
Boc-ethylenediamine | CNH Technologies | C-1112 | Cationic side-chain amine |
t-Butyl beta-alanine HCl | Chem-Impex International | 04407 | Anionic side-chain amine |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | C8982-10X10MG | For MALDI matrix |
Nile Red | Sigma Aldrich | 19123-10MG | For fluorescence Imaging |
Dichlorodimethylsilane | Sigma Aldrich | 80430-500G-F | For siliconization of glass reaction vessels |
Disposable PP fritted cartridge | Applied Separations | 2416 | 6 mL polypropylene cartridge with 20 mm PE frit |
Disposable 3 way luer adapter | Cole Parmer | 31200-80 | Stopcock for disposable manual synthesis reaction vessel |
Luer Lock ring | Cole Parmer | 45503-19 | ¼” fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
Fittings Luer | Cole Parmer | 45500-20 | ¼” fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
Disposable PP pipets | VWR | 16001-194 | For TFA transfers |
Luer lock plastic syringe | National Scientific | S7515-5 | 6 mL syringes |
1 dram glass vial | VWR | 66011-041 | With phenolic molded screw cap with polyvinyl-faced pulp liner |
20 mL scintillation vial | VWR | 66022-060 | With attached PP cap and pulp foil liner |
Secure-Seal adhesive spacer | Invitrogen | S-24736 | For fluorescence imaging |
Glass slides | Electron Microscopy Sciences | 63411 | For fluorescence imaging |
Cover slip | VWR | 48366-067 | For fluorescence imaging |
4” Silicon wafer | Ted Pella | 16007 | Pre-dice in 5×7 mm chips |
0.45 filter | VWR, Acrodisc | 28143-924 | For HPLC. PTFE membrane |
Agarose | BD | 212272 | For fluorescence imaging |
SPE Vacuum Manifold | Sigma Aldrich | 57044 | Example of SPE vacuum manifold |
Fritted glass vessel | Ace glass | 6402-12 | Porosity C frit |
Plasma Cleaner/Sterilizer | Harrick Plasma | PDC-32G | Example of plasma cleaner to prepare silicon chips for SEM |