Summary
مسح سريع باستخدام voltammetry دوري لقياس أثار كهربائيا ديناميات الدوبامين في الدماغ قبل المشبكي في شرائح الجسم المخطط.
Abstract
وقد تركزت أبحاث مستفيضة حول الدوبامين ناقل عصبي نظرا لأهميته في آلية عمل لتعاطي المخدرات (الكوكايين والأمفيتامين مثلا) ، والدور الذي تلعبه في الأمراض النفسية (مثل الفصام واضطراب نقص الانتباه فرط النشاط) ، ومشاركتها في التنكسية اضطرابات مثل مرض باركنسون ومرض هنتنغتون. في ظل الظروف الفسيولوجية الطبيعية ، ويعرف الدوبامين لتنظيم النشاط الحركي ، والإدراك ، والتعلم ، وتؤثر العاطفي ، والغدد الصم العصبية إفراز الهرمونات. واحدة من أكبر كثافة من الخلايا العصبية الدوبامين هو ضمن المخطط ، والتي يمكن تقسيمها في المنطقتين تشريحي عصبي متميزة تعرف باسم النواة المتكئة وputamen المذنبة. الهدف هو توضيح بروتوكول عام لشريحة voltammetry دوري سريع الفحص (FSCV) ضمن المخطط الماوس. FSCV هي تقنية كهربائية محددة جيدا وإتاحة الفرصة لقياس امتصاص الدوبامين والافراج في الوقت الحقيقي في دiscrete مناطق الدماغ. وتستخدم ألياف الكربون microelectrodes (قطرها ميكرون 7 ~) في FSCV للكشف عن الأكسدة الدوبامين. ميزة استخدام FSCV التحليلية للكشف عن الدوبامين هو قرارها الزمنية معززة من 100 ميلي ثانية ، والقرار المكاني لأقل من عشرة ميكرون ، وتوفير معلومات تكميلية لmicrodialysis في الجسم الحي.
Protocol
1. التجريبية الضروريات
القطب التصنيع
- هناك العديد من طرق تصنيع ألياف الكربون microelectrodes مصنوعة منذ أكثر في المنزل. عادة ما تملي تفاصيل تلفيق الكهربائي هو الأسلوب الكهروكيميائية التي يتم تطبيقها على القطب (مثل amperometry مقابل FSCV). لFSCV ، يمكن إجراء microelectrodes في المنزل باستخدام ما يلي ثلاث خطوات الإجراء. للحصول على وصف أكثر اكتمالا لتصنيع ألياف الكربون القطب ، راجع مقالة إن الرب الاخيرة 1. ومع ذلك ، نلاحظ أن أقطاب المبينة أدناه هي اسطوانية microelectrodes ألياف الكربون ، والتي تتطلب خطوات أقل لتلفيق مقابل microelectrodes ألياف الكربون amperometric من البروتوكول المذكور أعلاه. هذا البروتوكول المبسط لا يتطلب غلي ألياف الكربون في الأسيتون ، النار تلميع الزجاج الشعيرات الدموية ، أو استخدام الايبوكسي لاغلاق تقاطع الألياف الزجاجية.
- باستخدام الفراغ aspir الشفطأكلت من ألياف الكربون (قطرها 7 ميكرون ؛ Goodfellow أكدل ، والسلطة الفلسطينية) الى الزجاج البورسليكات الشعرية مع microfilament (طول 10 سم ، والتطوير التنظيمي 1.2 ملم ، 0.68 ملم معرف ، ونظم صباحا ، Carlsborg ، WA).
- وضع الخيوط الشعرية في القطب مجتذب (Narishige ، طوكيو ، اليابان) ، حيث يتم سحبها الشعرية في النصف. لا تختلف إعدادات الإخراج للمجتذب الكهربائي من المختبر إلى المختبر. للإشارة ، ضبط الانتاج لدينا هي لمجتذب 90.7 المغناطيس الرئيسي ، و 23.2 المغناطيس الفرعي ، و 53.4 للتدفئة. ينبغي أن تكون إعدادات إخراج المكرر تجريبيا لتوليد تفتق الزجاجية التي ما يقرب من 4.4 ملم في الطول ، مع ختم مشددا حول الألياف الكربونية.
- تحت المجهر (أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان) ، وتقليم ألياف الكربون (باستخدام شفرة مشرط) تمتد من طرف زجاج السماح حوالي 50-200 ميكرون من ألياف الكربون لتبرز من واجهة مغلقة بإحكام.
حل التحضير
ثلاثة أنواع من سير الاصطناعيbrospinal السائل (aCSF) الحاجة إلى حلول تكون معدة مسبقا ، وكلها في الماء (18 سم MΩ) عالى النقاء.
- يمكن تحضير السكروز - aCSF على الأقل قبل يوم واحد تشريح. المخزن المؤقت السكروز - aCSF يتكون من (مم) : 180 السكروز ، 30 كلوريد الصوديوم ، 4.5 بوكل ، 1.0 MgCl 2 و 26 NaHCO 3 ، 1.2 ناه 2 ص 4 ، و 10 مد الجلوكوز (7.4 درجة الحموضة) ، وينبغي استخدام الاوكسيجين 95 ٪ O CO 2 / 2 5 ٪ لمدة 15 دقيقة 2. إذا أعدت في وقت مبكر ، ويمكن أن تظل الحل مبردة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
- وينبغي إعداد ACSF حل للتسجيلات voltammetric يوم من التجربة. الحل aCSF يتكون من (مم) : 126 كلوريد الصوديوم ، و 2.5 بوكل ، 2.4 CaCl 2 ، 1.2 MgCl 2 و 25 NaHCO 3 ، 1.2 ناه 2 ص 4 و 11 مد الجلوكوز ، 0.4 حمض الاسكوربيك (الرقم الهيدروجيني 7.4). أثناء التجربة ، التي ظهرت على السطح مع الأوكسجين 95 ٪ O2 / 5 ٪ CO 2 في درجة حرارة الغرفة.
- معدلةaCSF حل لالمعايرة القطب يحتوي على (مم) : 2.5 بوكل ، 126 كلوريد الصوديوم ، 1.2 ناه 2 ص 4 ، CaCl 2 2.4 و 1.2 MgCl 2 ، و 25 NaHCO 3 (7.4 درجة الحموضة) ويمكن الاحتفاظ به لمدة تصل إلى أسبوع واحد ، من دون التبريد أو الأوكسجين.
القطب المعايرة
- يتم تحديد صلاحية الكهربائي والحساسية التي كتبها قبل وبعد معايرة ، على التوالي ، وذلك باستخدام تدفق "T - الخلية" التي تحتوي على 3 منافذ مع الإلكترود المرجعي مختومة (AG / AgCl). وخفضت microelectrode ملفقة في تدفق "خلية - T". توصيل منفذ مدخل إلى ضخ حقنة ، والسماح لاستمرار تدفق معدلة aCSF بمعدل تدفق 2 مل / دقيقة. يرتبط الميناء الثالث من "خلية - T" لحقنة مليئة الدوبامين ميكرومتر 3 ، المحرز في aCSF معدلة.
- إلى ما قبل معايرة ، والسماح تعديل aCSF حل لتدفق حوالي 3-7 ثوان ، ثم ضخها يدويا 1-2 مليلتر من مستوى الدوبامين 3 ميكرومتر. لكل إلكترودأن تكون محسوبة مسبقا ، كرر المعايرة على الأقل 3 مرات ومتوسط التيارات القصوى التي تم الحصول عليها من كل منهما.
- مباشرة بعد تجربة شريحة voltammetry (انظر القسم 3) ، والقطب هو آخر معايرة بنفس الطريقة كما هو موضح أعلاه.
- يتم تحديد عامل المعايرة (تستخدم في وقت لاحق خلال تحليل البيانات) عن طريق قسمة الأكسدة الدوبامين المتوسط الحالي (NA) عن طريق تركيز مستوى الدوبامين. على سبيل المثال ، يتم تقسيم الاستجابة الحالية بنسبة 3 عند استخدام معيار الدوبامين 3 ميكرومتر.
2. إعداد شريحة
- صب 10 مل من aCSF السكروز في كوب صغير ومكان في دلو الجليد. بالإضافة إلى ذلك ، لاصق مكان الفورية (وكتايت 404) في دلو الجليد ، في متناول اليد.
- إعداد شفرة حلاقة والأدوات اللازمة للتشريح ، مثل الملقط ، ملعقة ، ومقص ، والتي تمسح بها على وسادة نظيفة مع الكحول.
- التضحية الماوس خنقا CO 2 في تشا غاز صغيرةmber ، تليها قطع الرؤوس على الفور باستخدام مقص حاد. إزالة بسرعة الدماغ بأكمله. مكان الدماغ في دورق من aCSF السكروز الجليد الباردة لنحو 10 دقيقة.
- في غضون ذلك ، وإعداد Vibratome لتشريح. أولا ، وضع بعض الثلج المجروش في الحمام العينة. موقف غرفة العينات وتشديد لأنه عقد ثابتا في مكانه. إضافة مزيد من الجليد في أنحاء الغرفة عينة لملء الثغرات في والتأكد من الجليد لا يحصل في الغرفة. وضع شفرة حلاقة في تنظيف حامل شفرة على Vibratome وملء الغرفة مع عينة aCSF السكروز الجليد الباردة.
- لإنشاء سطح العمل لإعداد الدماغ ، صب بعض aCSF السكروز الباردة على قطعة من الورق منشفة التي تم وضعها على طبق بتري مقلوبة. ملقط باستخدام الدماغ نقل على طبق بيتري المعدة. للشرائح الإكليلية ، وقطع المخيخ على طول المحور الأفقي الإنسي - بشفرة حلاقة وتجاهل. هذا يخلق قاعدة مسطحة يمكن اضافته الى مرحلة Vibratome.
- مكانقطرة من لاصقة وكتايت (وضعت في دلو الجليد خلال الخطوة 1) في المرحلة العينة. على الفور ، يضعوا نهاية شقة من الدماغ أعدت على المسرح ، والحفاظ عليها تستقيم ممكن. مكان المنصة في غرفة العينات وتشديد المسمار ، وضمان مغمورة تماما في الدماغ aCSF السكروز في الغرفة.
- باستخدام عناصر التحكم في الجزء الأمامي من ضبط Vibratome المرحلة بحيث خطوط شفرة حلاقة مع الجزء العلوي من الدماغ. ويتم الحصول على أفضل المعايير لVibratome عن طريق تعيين وتيرة وسرعة إلى منخفض. ويفضل أقل سرعة للحد من قوة النصل من سحق الدماغ ، الذي يحتفل به في السرعات العالية. يتم تعيين سمك شريحة الى 400 ميكرون.
- سوف الشرائح القليلة الأولى لا تحتوي على المخطط. تكرار حتى يتم الحصول على تقطيع الشرائح التي تحتوي على المخطط. مرة واحدة يتم الوصول إلى المنطقة مخططي (أكده معالم تشريحية) ، واستخدام فرشاة الطلاء لرفع شريحة وضعها في كوب معالاوكسيجين ، درجة حرارة الغرفة aCSF. عادة ، يمكن للمرء الحصول على 3-4 شرائح تحتوي على مخططي معقدة بحيث يتم تضمين المذنبة ، والمتكئة putamen النواة.
- السماح للشرائح حتى يتأقلم في aCSF الاوكسيجين في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل استخدام لإجراء التجارب.
3. Voltammetric تسجيلات من شرائح
بينما تحتضن شرائح ، يمكن إعداد غرفة تسجيل شريحة.
- تتخذ أنابيب متصلة غرفة تسجيل غمر (مخصص العلمية ودنفر ، أول أكسيد الكربون) ووضعه في بالاكسجين ، aCSF درجة حرارة الغرفة. تعيين مضخة الارواء (مارلو واتسون المحدودة ، فالماوث ، انكلترا) إلى معدل التدفق من 1 مل / دقيقة. تعيين تحكم في درجة الحرارة إلى 32 درجة مئوية. بعد aCSF يملأ صاحب شريحة مبنية خصيصا (تعديل شبكة مرحلة القرص) ، يكون جاهزا لشريحة من خلال إزالة أي فقاعات الهواء باستخدام إبرة حقنة دينار بحريني (إبرة في العمود الفقري).
- رئيس الوزراء الحمام شريحة عن طريق رسم الفراغ علىأنابيب تدفق (مما يؤدي إلى زجاجة النفايات السائلة) باستخدام حقنة لبدء التدفق. وضع kimwipe ليكون بمثابة الفتيل على حافة حامل للسيطرة على شريحة سعة المخزن المؤقت.
- بعد الحضانة 1 ساعة ، ونقل الشرائح لصاحب شريحة في غرفة التسجيل ، وهو perfused باستمرار مع 95 ٪ O 2 / 5 ٪ ثاني درجة حرارة الغرفة 2 aCSF.
- غمر الإلكترود المرجعي حج / AgCl في حامل شريحة (مسجلة لغطاء غرفة شريحة) وتوصيل الكهربائي باستخدام مشبك التمساح إلى مرحلة الرأس.
- يمكن جعل الإلكترود المرجعي حج / AgCl في المنزل من خلال أنودة (+1 V) سلك الفضة 250 ميكرون (AM الأنظمة ، Carlsborg ، WA) في حمض الهيدروكلوريك M 1 لمدة 5 دقائق لإيداع طبقة رقيقة من AgCl على سطح فضية الأسلاك.
- انخفاض القطب تحفيز التنغستن (بلاستيك واحد ، رونوك ، فرجينيا) إلى سطح الجسم المخطط شريحة الدماغ. القطب تحفيز يجعل الاتصال مع شريحة لأنها تقع على قمةلذلك ، ولكن ينبغي أن لا ثقب شريحة. في تجاربنا مجموعة المتابعة ، يتم إنشاء تنبيه من قبل Neurolog مشجعا.
- من ألياف الكربون microelectrode العمل هو العودة مليئة حل بوكل 150 مم باستخدام إبرة دينار بحريني الشوكي. ثم يتم إدخال سلك الرصاص (الإقطاعيون إلكترونيات ، كورنيليوس ، أو) ، وهذا مرتبط إلى مرحلة رئيس الضوضاء المنخفضة ChemClamp potentiostat (الشركات داغان ، مينيابوليس ، مينيسوتا) باستخدام مشبك التمساح. يتم وضع قطب كهربائي يعمل ما يقرب من 100 -- 200 ميكرون بعيدا عن القطبين تحفيز كهربائي ، حوالي 75 ميكرومتر في عمق شريحة.
- يتم تسليم التحفيز الكهربائي ، وذلك باستخدام إما واحد (وحيد الطور ، و 350 أمبير ، 60 هرتز ، و 4 عرض نبضة مللي) أو متعددة (مثل البقول 5 أمبير 350 ، 20 هرتز ، و 4 مللي واسعة) والبقول ، وذلك القطب تحفيز لاستحضار العصبي اطلاق سراح 3.
- لقياس أثار الدوبامين كهربائيا باستخدام FSCV ، يتم تطبيق الموجي المثلث إلى القطب. نموذجي للمعلمات DOPكشف أمين : يعقد المحتملة للألياف الكربون microelectrode -0.4 في الخامس مقابل الإلكترود المرجعي حج / AgCl ، رفعت إلى حد الإيجابية +1.2 V ، جلبت ثم تتراجع إلى -0.4 V بمعدل مسح من 400 V / ثانية .
- ويتم تحفيز كهربائيا شريحة تتم كل 5 دقائق والقياسات voltammetric من هروب رأس المال الناتجة الدوبامين لمدة 15 ثانية.
- بعد ثلاثة على الاقل مستقرة تحفز كهربائيا التسجيلات الإفراج الدوبامين (الفرق بين ارتفاع ذروة <10 ٪) ، والتي تحتوي على عامل perfused aCSF الدوائية الفوائد في معدل التدفق من 1 مل / دقيقة أكثر من شريحة لمدة 30 دقيقة للحصول على تأثير القصوى. والتسجيلات الدوبامين حفز كهربائيا كل 5 دقائق خلال نضح الدوائية.
4. تحليل البيانات
يمكن أن يكون لائقا آثار الناجمة الحالي مقابل الوقت تم الحصول عليها من قبل شريحة الانحدار غير الخطية لمجموعة من ميكايليس - Menten المعادلات القائمة ، والتي وصفها ايتمانوالزملاء في برنامج مكتوب في ابفيو (LabVIEW) (صكوك الوطنية ، أوستن ، تكساس) و 4-6. في هذا البرنامج ، يمكن تركيبها آثار الحالي مقابل وقت متفاوتة معلمتين ، والخامس ماكس (نيوتن متر / ثانية ؛ المقابلة لمعدل امتصاص الناقل الدوبامين ، كما ظهر من المرحلة الهابطة من التتبع) وتركيز الدوبامين في النبضة (NM ؛ المقابلة لأقصى ارتفاع الذروة). يتم تعيين قيمة K م ، وهذا انعكاس للتقارب من الدوبامين لنقل الدوبامين ، إلى 160 نيوتن متر وتتغير. مطلوب القطب في مرحلة ما بعد المعايرة العوامل التي يتحدد بعد التجربة قبل المناسب. البرنامج يحتوي على LABVIEW معامل التحديد (R 2) معلمة لتحديد صلاح صالح (R 2 القيم تستخدم> 0.8).
5. ممثل النتائج
كان يستخدم لفحص FSCV نبض واحد ، والإفراج عن الدوبامين حفز كهربائيا والامتصاص في رمي المذنبةآمين (CPU) ، النواة المتكئة (NAC) الأساسية ، ورنا قذيفة في الفئران. ممثل النتائج المبينة في الشكل 1A تثبت المؤامرات الحالية (أو تركيز) مقابل الوقت. السهم الأحمر يشير إلى متى يتم تطبيق التحفيز الكهربائي لشريحة تليها يقابله ارتفاع في كمية الحالية التي تعزى إلى تغييرات في تركيز الدوبامين في microelectrode الكربون الألياف. عملية السائد خلال التحفيز الكهربائي وإطلاق الدوبامين ، ولكن العمليات الأخرى مثل امتصاص ونشرها يسهم في ارتفاع ذروة وحظ بشكل عام. ويعزى بشكل رئيسي في المرحلة الهابطة من القمة إلى امتصاص للنقل بواسطة ناقل عصبي له منذ تحفيز الخلايا العصبية تم إيقاف 7. ومع ذلك ، لا يقتصر على امتصاص ذروة الانحطاط ، ونشرها وتسهم أيضا في عملية التمثيل الغذائي في الانخفاض في الحالية. وقد افترض أن النطاق الزمني منذ القياسات الكهروكيميائية هي مسألة ثانية ، FSCV سريع جدا لقياس contributioنانوثانية من 7 الأيض. في هذه تتبعات مقابل الوقت الحالي ، يتم تحويل المحور الصادي لتركيز (ميكرومتر) باستخدام معامل المعايرة بعد التجربة. وأقحم ل1A الشكل هي الخلفية منها طرح voltammograms دوري للآثار الحالية مقابل الوقت. التآمر الحالي يقاس (ذ المحور) ضد إمكانات تطبيقها على القطب (محور س) ، يتم التعرف كيميائيا الدوبامين مع الأكسدة لوحظت في ذروة +0.6 الخامس وذروة انخفاض مماثل من كينون ، الدوبامين ، لوحظ في أورثو -- 0.2 V مقابل الإلكترود المرجعي حج / AgCl. التمثيل الثالث للبيانات يستخدم ثلاثي الأبعاد شبه مؤامرة اللون (الشكل 1B) يجمع المعلومات من كل من يتتبع الحالي مقابل الوقت وvoltammogram دوري لتشكيل قطعة واحدة. في المؤامرة شبه ممثل اللون ، يتم رسم الوقت بالثواني على طول المحور x ، فإن رسوم بيانية الجهد المطبق على الألياف الكربونية microelectrode تعمل على طول محور ذ ، ويتم تمثيلها الحالي كما فالاللون ذاته على طول محور ض. نظرا لصغر حجم microelectrodes ألياف الكربون (~ 7 ميكرومتر في القطر) ، ويمكن الكشف عن ديناميات الدوبامين تحفز كهربائيا في مناطق منفصلة التشريحية للالمخطط (CPU مقابل رنا الأساسية مقابل قذيفة رنا ؛ الشكل 2).
ميزة استخدام شرائح الاكليلية الجسم المخطط هو أنه يلغي مساهمات من الهيئات الخلية الدوبامين ، ويسمح لإجراء تحقيق في ديناميات الدوبامين قبل المشبكي. لا تحكم قبل المشبكي الإفراج الدوبامين وامتصاص يقتصر على autoreceptor الدوبامين أو وظائف نقل مثل الآخرين أظهرت 16 و 17. Heteroreceptors نظم أخرى تعدل العصبي الدوبامين أيضا ديناميات 18 و 19. اثار الممثل الحالي مقابل الزمن هو مبين في الشكل 3A تثبت أنه عندما يتم التعامل مع شرائح quinpirole ميكرومتر 1 (D2/D3 ناهض مستقبلات) لمدة 30 دقيقة ، وانخفاضا في إطلاق الدوبامين كهربائيا أثار لوحظ. من ناحية أخرى ، عندما ركيزةلperfused هو الناقل الدوبامين ، مثل الميثامفيتامين ، على شريحة لمدة 30 دقيقة ، يلاحظ وجود أي اختلاف في إطلاق الدوبامين (الشكل 3B). يتم إزاحة تسوس الذروة إلى اليمين ، والتي ترتبط عادة مع بعض التعديلات في حركية نقل الدوبامين (K م) 3. أخيرا ، الشكل 3C هو تتبع ممثل التتبع الحالي مقابل الوقت بمجرد استحم شريحة في 100 نانوغرام / مل حل الدماغ الناجم عن عصبية (BDNF) عامل ، والذي تم الافتراض على التأثير في ديناميات إطلاق الدوبامين 20 و 21. من هذا التتبع ممثل ، يمكن اعتبار أن عامل التغذية العصبية الدماغي لديه القدرة على تعزيز كهربائيا أثار إطلاق الدوبامين. مجتمعة ، هذه العلاجات الدوائية التأكيد على فائدة لبحث ديناميات FSCV الدوبامين في المخطط.
الحد من استخدام شرائح الأولية للتحقيق في الدماغ قبل المشبكي ديناميات الدوبامين التي FSCV هو أن فقدت العصبية من الدماغ سليمة.FSCV مع شريحة من المستحيل دراسة آثار العصبية من مناطق أخرى من الدماغ ، مما يجعل من الصعب فهم مساهمات هذه النظم على وظيفة في المنطقة التي يجري التحقيق فيها (مثل المخطط) ، أو لتقييم مستويات الدوبامين غير حفز. ومع ذلك ، فقد سمحت التطورات التقنية الحديثة في FSCV لقياسات عابرة الدوبامين (مع وبدون التحفيز الكهربائي) في الفئران تتحرك بحرية ردا على التلاعب الدوائية ، والإدارة الذاتية ، أو الجدة 22-24. عموما ، FSCV شريحة يوفر معلومات قيمة عن ديناميات الدوبامين قبل المشبكي ، واقتران النتائج FSCV شريحة إلى التقنيات الكيميائية العصبية التكميلية مثل microdialysis ، الكهربية ، و / أو التحرك بحرية FSCV يقدم رؤية أكثر شمولا للسير ناقل عصبي في الدماغ.
الشكل 1. كهربائيا أثار dopaminه الإفراج يقاس به FSCV التالية نبض واحد في تحفيز شرائح CPU الظهرية من الفئران C57Bl/6J. (أ) في مقابل تركيز تتبع في الوقت الذي أثار الإفراج الدوبامين التي كتبها نبضة واحدة (السهم الأحمر). العلامة النجمية واحد يمثل العوامل التي تسهم في ارتفاع في تركيز ، والتي هي في الغالب الافراج عن الدوبامين ، ولكن امتصاص ونشر المساهمة أيضا. النجمة المزدوجة يمثل ذروة إشارة العودة إلى الأساس ، ويرجع ذلك أساسا إلى امتصاص بل تسهم أيضا نشرها. أقحم يعرض voltammograms دوري المناظرة. (ب) قطع اللون الممثل من وقت وحدة المعالجة المركزية عرض الظهرية (محور س) ، وتطبق المحتملة للألياف الكربون microelectrode مقابل الإلكترود المرجعي حج / AgCl (ذ المحور) ، وحاليين في الألوان الزائفة.
الافراج عن الدوبامين الرقم 2. استحضر بواسطة التحفيز الكهربائي نبضة واحدة (يشار إليه السهم الأحمر) في قلب رناوقذيفة من الفئران C57Bl/6J. (A و C) في مقابل تركيز آثار الزمن وvoltammograms من دوري المقابلة (الشكل) من صميم رنا وقذيفة. (B و D) كما هو موضح سابقا ، وممثل عن مؤامرات الألوان الأساسية رنا وقذيفة.
الشكل 3 عولج اثار الممثل بعد شريحة مع وكيل الدوائية لمدة 30 دقيقة ، وفي جميع الحالات ، كان يستخدم نبضة واحدة لاستحضار إطلاق الدوبامين في وحدة المعالجة المركزية. (أ) تطبيق ناهض مستقبلات الدوبامين D2 ، quinpirole (أحمر التتبع) بالمقارنة مع ما قبل المعالجة (تتبع السوداء). (ب) نضح الميثامفيتامين (تتبع الأرجواني) مقارنة مع ما قبل المعالجة (تتبع السوداء). (ج) قدرة عامل التغذية العصبية في الدماغ الناجم عن التأثير على ديناميات الدوبامين (الأزرق التتبع) بالمقارنة مع ما قبل المعالجة (تتبع السوداء).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول المعروضة هنا يوضح كيفية إعداد واستخدام شرائح دماغ الفأر الاكليلية للتجارب FSCV. على الرغم من أن هذا الأسلوب هو الحصول على ومحددة لقياس ديناميكية الدوبامين ، الناقلات العصبية الأخرى مثل الأدينوزين ، وقد تم رصد بيروكسيد الهيدروجين ، بافراز ، والسيروتونين في الجسم الحي أو في المختبر مع FSCV 3 ، 8 -- 11. ويمكن استخدام FSCV لرصد بعض هذه neurochemicals غيرها من التعديلات البسيطة للالموجي تطبيقها على مسرى العمل 3 و 11. لأن العديد من هذه الأنواع من إمكانيات الأكسدة الكيميائية العصبية مماثلة ، voltammograms دوري لدت تقديم بصمة كيميائية فريدة لكل نوع قابل للأكسدة ، والتي تسمح بتحديد الكيميائية. علاوة على ذلك ، وقد استخدمت في FSCV مختلف الأنواع ، من ذباب الفاكهة لالرئيسات غير البشرية ، للحصول على فهم أفضل لالعصبي في هذه الكائنات النموذجي 12 -- 15. أحد الأسباب الأساسية التي قد FSCV بالتابعين متنوعة تستخدم في مثل هذه الأنواع ويرجع ذلك إلى القطر الصغير من ألياف الكربون microelectrodes ، وعادة أقل من 7 ميكرون في القطر. نتيجة لذلك ، هذه microelectrodes تجعل من الممكن أخذ عينات الأنسجة من بيئات صغيرة جدا ، كما هو الحال بالنسبة للفواكه الدماغ ذبابة (NL) ، أو للتمييز من مناطق شبه منفصلة التشريحية الأساسية مثل رنا مقابل قذيفة في جو من الأنواع 12 -14.
في الختام ، قدم هنا النتائج تثبت أن voltammetry شريحة أداة لا تقدر بثمن الكهروكيميائية للتحقيق قبل المشبكي ديناميات الدوبامين في المخطط الماوس. ويركز على بيانات تمثيلية perfusing كلاء الدوائية على شريحة من الدماغ «طبيعية أو صحية' لمراقبة والقدرة على تميز معايير الافراج عن الدوبامين وامتصاص. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام FSCV لتقييم الاختلافات في حفز الافراج كهربائيا والمعلمات في امتصاص الحيوانات المعدلة وراثيا أو المعالجة من تلقاء نفسها أو بعد pharmacological العلاج 15-16. FSCV شريحة يوفر فرصة فريدة لتحقيق الديناميات العصبي الدوبامين داخل المناطق التشريحية المنفصلة التي تحدث على مقياس من ميلي ثانية. عموما ، فإن تقنية الكهروكيميائية FSCV يوفر كل قرار تعزيز المكانية والزمانية مقارنة مع التقنيات الكيميائية العصبية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
التمويل المقدم من قبل المعهد الوطني لتعاطي الكحول والإدمان على الكحول (NIAAA ؛ AA - 016967 وAA016967 01S1 ؛ TAM) ، جامعة واين ستيت بدء الأموال ، وجامعة واين ستيت برنامج منح البحوث. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل وجهة النظر الرسمية للNIAAA أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | 7447407 | |
| Sodium chloride | EMD Millipore | 7647145 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 7791186 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035048 | |
| Sodium bicarbonate | EMD Millipore | 144558 | |
| Sodium phosphate,Dibasic | EMD Millipore | 7558794 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | 50997 | |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | 50817 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57501 | |
| Carbon fiber | Goodfellow | ||
| Glass capillary | A-M Systems | 602000 | |
| Silver wire | A-M Systems | 787000 | |
| Tungsten stimulating electrode | Plastics One | ||
| Platinum wire | |||
| Lead wire | Squires Electronics, Cornelius, OR | ||
| Loctite 404 instant adhesive | Hankal Corp. | ||
| Razor blade | World Precision Instruments, Inc. | ||
| BD Spinal needle | BD Biosciences | REF 405234 | |
| Surgical Blade | Feather Safety Razor Co, Ltd. | ||
| TH software | ESA Inc.,Chelmsford, MA | ||
| Submersion recording chamber | Custom Scientific | ||
| Neorolog stimulus isolator |  Digitimer Ltd. |
NL800A | |
| Automatic temperature controller | Warner Instruments | ||
| Microscope (SZX7) | Olympus Corporation | ||
| Microscope | Fisher Scientific | ||
| Vibratome 3000 sectioning system | St. Louis , MO. | ||
| Perfusion pump | Watson-Marlow Pumps Group | H110708 | |
| Micropipette puller | Narishige International | ||
| ChemClamp potentiostat | Dagan Corporations |
References
- Pike, C. M., Grabner, C. P., Harkins, A. B.
- Lack, A. K., Diaz, M. R., Chappell, A., DuBois, D. W., McCool, B. A. Chronic ethanol and withdrawal differentially modulate pre- and postsynaptic function at glutamatergic synapses in rat basolateral amygdala. J. Neuropyhysiol. 98, 3185-3196 (2007).
- John, C. E., Jones, S. R. Voltammetric characterization of the effect of monoamine uptake inhibitors and release on dopamine and serotonin uptake in mouse caudate-putamen and substantia nigra slices. Neuropharmacology. 52, 1596-1605 (2007).
- Wightman, R. M., Amatore, C., Engstrom, R. C., Hale, P. D., Kistensen, E. W., Kuhr, W. G., May, L. J. Real-time characterization of dopamine overflow and uptake in the rat striatum. Neuroscience. 25, 513-523 (1988).
- Wightman, R. M., Zimmerman, J. B. Control of dopamine extracellular concentration in rat striatum by impulse flow and uptake. Brain. Res. Brain. Res. Rev. 15, 135-144 (1990).
- Jones, S. R., Garris, P. A., Kilts, C. D., Wightman, R. M. Comparison of dopamine uptake in the basolateral amygdaloid nucleus, caudate-putamen, and nucleus accumbens of the rat. J. Neurochem. 64, 2581-2589 (1995).
- Michael, D. J., Wightman, R. M. Electrochemical monitoring of biogenic amine neurotransmission in real time. J. Pharm. Biomed. Anal. 19, 33-46 (1999).
- Pajski, M. L., Venton, B. J. Adenosine release evoked by short electrical stimulations in striatal brain slices is primarily activity dependent. A.C.S. Chem. Neurosci. 1, 775-787 (2010).
- Sanford, A. L., Morton, S. W., Whitehouse, K. L., Oara, H. M., Lugo-Morales, L. Z., Roberts, J. G., Sombers, L. A. Voltammetric detection of hydrogen peroxide at carbon fiber microelectrodes. Anal. Chem. 82, 5205-5210 (2010).
- Park, J., Kile, B. M., Wightman, R. M. In vivo voltammetric monitoring of norepinephrine release in the rat ventral bed nucleus of the stria terminalis and anteroventral thalamic nucleus. Eur. J. Neurosci. 30, 2121-2133 (2009).
- Hashemi, P., Dankoski, E. C., Petrovic, J., Keithley, R. B., Wightman, R. M. Voltammetric detection of 5-hydroxytryptamine release in the rat brain. Anal. Chem. 81, 9462-9471 (2009).
- Borue, X., Cooper, S., Hirsh, J., Condron, B., Venton, B. J. Quantitative evaluation of serotonin release and clearnece in drosophila. J. Neuroscience. Methods. 179, 300-308 (2009).
- Vickrey, T. L., Condron, B., Venton, B. J. Detection of endogenous dopamine changes in drosophila melanogaster using fast-scan cyclic voltammetry. Anal. Chem. 81, 9306-9313 (2009).
- Makos, M. A., Han, K. A., Heien, M. L., Ewing, A. G. Using in vivo electrochemistry to study the physiological effects of cocaine and other stimulants on the drosophila melanogaster dopamine transporter. A.C.S. Chem Neurosci. 1, 74-83 (2009).
- Budygin, E. A., John, C. E., Mateo, Y., Daunais, J. B., Friedman, D. P., Grant, K. A., Jones, S. R. Chronic ethanol exposure alters presynaptic dopamine function in striatum of monkeys: a preliminary study. Synapse. 50, 266-268 (2003).
- Jones, S. R., Gainetdinov, R. R., Jaber, M., Giros, B., Wightman, R. M., Caron, M. G. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. PNAS. 95, 4029-4034 (1998).
- Kennedy, R. T., Jones, S. R., Wightman, R. M. Dynamic observation of dopamine autoreceptor effects in rat striatal slices. J. Neurochem. 59, 449-445 (1992).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nat. Neurosci. 7, 583-584 (2004).
- Zhang, L., Doyon, W. M., Clark, J. J., Phillips, P. E., Dani, J. A. Controls of tonic and phasic dopamine transmission in the dorsal and ventral. 76, 396-404 (2009).
- Paredes, D., Grnaholm, A. C., Bickford, P. C. Effects of NGF and BDNF on baseline glutamate and dopamine release in the hippocampal formation of the adult rat. Brain. Res. 11141, 56-64 (2007).
- Goggi, J., Puller, I. A., Carney, S. L., Bradford, H. F. Signalling pathways involved in the short-term potentiation of dopamine release by BDNF. Brain. Res. 968, 156-161 (2003).
- Cheer, J. F., Wassum, K. M., Heien, M. L., Phillips, P. E., Wightman, R. M. Cannabinoids enhance subsecond doapmine relese in the nucleus accumbens of awake rats. J. Neurosci. 24, 4393-4400 (2004).
- Phillips, P. E., Stuber, G. D., Heien, M. L., Wightman, R. M., Carelli, R. M. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422, 614-618 (2003).
- Robinson, D. L., Heien, M. L., Wightman, R. M. Frequency of dopamine concentration transients increases in dorsal and ventral striatum of male rats duing introduction of conspecifics. J. Neurosci. 22, 10477-10486 (2002).
