确定的人口细胞的细胞周期的位置,或理解信号是如何影响扩散,可以很容易地通过使用此协议的流流式细胞仪测量。我们报告一个简单的实验方法,染色细胞和量化其在细胞周期中的位置。
调节细胞增殖,是中央组织的形态发生过程中的多细胞生物体的发展。此外,细胞增殖失控基础的癌症等疾病的病理。因此有很大的需要,可以研究细胞的增殖和定量细胞的细胞周期的每个阶段中的比例。也不加区别地识别细胞,他们的DNA复制在一个较大的人口,这是至关重要的。由于细胞的增殖的决定是在G1期前立即启动DNA的合成,并通过对细胞周期的其余部分进展,检测DNA合成在这个阶段允许在细胞培养中生长调节状态明确的决心实验。
可以很容易地在细胞DNA含量定量流式细胞仪碘化丙啶,荧光DNA插层染料染色的细胞。同样,活跃的DNA合成,可以定量培养细胞中存在放射性胸腺嘧啶,收获细胞,并测量放射性掺入到酸不溶性部分。我们有相当的专业知识与细胞周期分析,并推荐了不同的方法。我们使用溴脱氧尿苷/ fluorodeoxyuridine(简单缩写为BrdU)染色检测到最近合成的DNA的胸腺嘧啶类似物纳入研究细胞增殖。用BrdU标记和染色细胞相结合,与总DNA染色碘化丙啶和分析,流式细胞仪1细胞在细胞周期的各个阶段提供最准确的测量。这是我们的首选方法,因为它结合了活跃的DNA合成的检测,通过基于抗体的BrdU染色碘化丙啶的总DNA含量。这可以明确分离的细胞在G1,S早期阶段或后期小号从G2 / M期此外,这种方法可以利用调查的进展,通过这些不同的细胞周期调控的许多不同的细胞刺激和药物制剂的影响。
在这份报告中,我们描述标签和染色培养细胞,以及他们用流式细胞仪分析的方法。这种方法可用于测量生长抑制信号从细胞因子,如TGF -β1和增殖抑制剂,如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27kip1的影响,我们还包括实验例子。我们还包括一个备用协议,允许细胞在一个较大的文化 5的一个亚群分析细胞周期的位置。在这种情况下,我们将演示如何检测即使未转染细胞大大多于在相同的文化与视网膜母细胞瘤基因转染细胞,一个细胞周期阻滞。这些例子说明,DNA染色的方法很多,可以利用流式细胞仪和适应研究哺乳动物细胞周期调控的根本问题。
根据我们的经验,这些技术的成功取决于几个关键控制和实验条件。其一是建立在这些实验中使用的异步增殖控制。这种控制有三个重要的目的。首先,它确保所有实验样品的培养条件足以支持在没有治疗的情况下不断扩散。这个范例,也是为阳性对照染色的方法,以确保BrdU或CD20阳性细胞时,可以检测到它们存在的目的。最后,这个范例是用于校准流式细胞仪。此对照样品可用于调整碘化丙啶染色强度检测2N和4N的细胞分别在200和400。此外,检测灵敏度可调节的BrdU或CD20的消极和积极的信号,使中心在图1A和2A所示。当所有样品有类似的细胞浓度PI – R激酶解决方案,则需要一些调整的流式细胞仪,随后样品运行。图的原因,这一点很重要。 4B和5B强烈的G1积累创建本质上是一个单一的G1峰可能被曲解为G2 / M
有代表性的实验,也使其他重要事项。首先,他们证明BrdU吸收和标签会有所不同类型的细胞。基于这个原因,重要的是要凭经验确定的脉搏和需要充分检测S期细胞的染色条件的长度。在一般情况下,,在文化双在24小时或更少的细胞类型可以在一个小时内用BrdU标记。增长较慢的细胞类型,可能需要较长的脉冲抗体染色的条件和期限,并改建。 MCF10A细胞在这方面一个很好的例子,因为他们用BrdU染色标记的四个小时,两次只要四倍的标准浓度的抗体。调查应小心不超过6个小时的BrdU的标签,即使非常缓慢生长的细胞,因为这可能会错误地导致G2 / M期细胞在S期的人口纳入。其次,在比较p27kip1蛋白表达的TGF -β1的影响,它是明确的,P27能诱导G1或G2 / M期的积累,而TGF -β1信号诱导G1期阻滞。如3 H – TdR掺入和闪烁计数检测增殖的传统手段是无法区分这些可能性。
在我们的备用协议,我们将演示在一个较大的未转染人口的细胞亚群检测。这是很重要的经验确定最合适的检测转染细胞记者。在我们的经验,一些类型的细胞无论是明示的细胞表面标志物不佳,或不能正确交通质膜,导致无法检测转染细胞。大号ikewise,并非所有的细胞容忍的绿色荧光蛋白的膜结合形式。选择最合适的记者应通过评估转染效率的记者以及表达的相对强度比未转染控制。理想的情况下,这些分子的异源表达会被很好的耐受性,这是暗示性的标志几乎没有细胞周期分布的影响。
这些类型的流式细胞仪检测方法的一个限制是,他们只能够建立到另一个细胞周期的相对丰度相比。出于这个原因,它是模糊的,如果图3 p27表达真正导致在G1和G2 / M,逮捕或如果它只是减缓相对S期通过这些阶段的进展。这些可能性可以进行进一步的调查,由一个平行样细胞治疗,如噻氨酯哒唑的有丝分裂抑制剂,或G1 / S期抑制剂如aphidicolin。由于这些药物创建一个多米纳NT逮捕M期或S早期阶段,分别缓慢增殖细胞会聚集在药物诱导逮捕点。对于被捕是因为在G1 pRB的表达,例如细胞将保持在G1尽管噻氨酯哒唑治疗,而对照组细胞会积聚在M 期 13 。
两者合计,这些实验方法提供了一个灵活的方法,可应用于广泛的哺乳动物细胞周期的研究问题。他们可以很容易地发现在细胞周期进程的改建和量化与对照相比,差异。
The authors have nothing to disclose.
作者衷心感谢加拿大卫生研究所(CIHR)和加拿大癌症协会的资金在他们的实验室中的细胞周期研究学院。 MJC是一架MD /博士研究生奖学金从CIHR收件人。 MJC和MA CaRTT培训计划的成员。
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Cell Proliferation Labeling reagent | GE Amersham | RPN201 | |
Anti-BrdU Antibodies | BD Biosciences | 347580 | |
Anti-Mouse FITC conjugated Antibodies | Vector Labs | FI-2000 | |
Cell Strain Filters | BD Falcon | 352235 | |
Anti-CD20 Antibodies | BD Biosciences | 347673 | |
Multi Cycle Software | Phoenix Flow Systems | N/A |