Метод условно нокдаун выражения целевого белка в сетчатку взрослых данио описывается, в котором участвуют intravitreally инъекционных антисмысловых morpholinos и electroporating их на сетчатке. В результате белок сбил в течение нескольких дней, что позволяет тестировать роль белка в регенерирующих или нетронутой сетчатку.
Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident Müller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons.
We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina.
Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or “knockdown” protein expression for three to five days 12.
Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells.
Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.
Недавно два микрочипов анализа рассмотрены экспрессии генов изменения, которые произошли во время регенерации или светового повреждения сетчатки или хирургически-вырезали сетчатки патч 10, 16. Оба исследования показали многочисленные гены, которые выставляются значительные изменения в выражении, увеличения или уменьшения, которые, вероятно, требуются для различных событий, которые происходят во время регенерации сетчатки, таких как вхождение в атмосферу глии Мюллера в клеточный цикл, продолжающийся пролиферацию и миграцию нейронов прародителей к поврежденной сетчатки слой, и дифференциация нейронов прародителей в правильный тип нейронов клетки. Хотя прямое сравнение этих двух наборов данных микрочипов выявить гены-кандидаты, которые могут быть задействованы в этих клеточных событий, в конечном счете этих генов и их белков закодированы должна быть проверена, чтобы определить, если они необходимы для регенерации нейронов. Здесь мы описываем мощный потерей функции подход к conditioНаконец нокдаун белков интереса к взрослой сетчатке рыбок данио. Эта техника была использована для изучения как вне-и внутриклеточных белков, а также сигнальные молекулы, факторы транскрипции и белков, необходимых для репликации ДНК 17-19. Таким образом, этот метод в значительной степени способствовал нашему пониманию молекулярного механизма, лежащего взрослого регенерации сетчатки в рыбок данио.
Мы протестировали несколько параметров электропорации (напряжения, число импульсов, время между импульсами), прежде чем успешным протокола была достигнута. Предыдущий доклад electroporating morpholinos в плавнике регенерирующим данио хвостового использовали 10 импульсов на низкое напряжение (15 В) 20. Потому что взрослые сетчатки данио окружен несколькими слоями клеток и не является легко доступным для пинцет электродов, параметры, используемые в плавнике были неудачны на эффективное electroporating morpholinos во взрослую сетчатки. И наоборот, высокое напряжение (100 В) часто разрешениемulted в смерти рыбы. Недавно, 5 импульсов 80 V был описан в electroporate плазмиды ДНК в новорожденной мыши щенка сетчатки 21. Мы обнаружили, что чуть менее интенсивным 2 импульсы 75 В в результате успешной электропорации morpholinos во взрослую сетчатки данио с выживанием в размере 100% обработанных рыбы. Кроме того, мы обнаружили, что удаление внешнего большинство (или внешнего большинство) компонента роговице значительно увеличилось электропорации эффективности. Увеличение числа импульсов может устранить необходимость удаления этой ткани, но также может привести к большей повреждения тканей. Обширные исследования показали, что контроль этих параметров не вызывает никаких значительных гибели клеток сетчатки или изменить специфический клеточный ответ наблюдается при регенерации фоторецепторов 19. Gain-функции исследования в настоящее время не возможно при использовании этого метода в естественных условиях, из-за нашей неспособности последовательно electroporate большой рибонуклеиновых кислот во все тetinal клеток. Тем не менее, успех electroporating плазмид в сетчатке мышей в естественных условиях и рыбок данио сетчатки в эксплантатах предполагает, что это все еще возможно в 21 данио, 22.
Одна из сильных сторон этого метода является электропорация появляется эффективно внедрять морфолино во все различные типы клеток сетчатки. Тем не менее, одна потенциальная слабость в том, что электропорации эффективно доставлен в морфолино только спинной и центральной сетчатки регионах. Второе событие электропорации к вентральной половины сетчатки приводит к хорошей ориентации для всех слоев, но часто приводит к ее повреждению. Это пространственное ограничение вероятно, была из-за формы и размещения электродов. Использование специально разработанных чашки формы электродов, которые могут быть размещены вокруг глаз может улучшить эту слабость. Это пространственное ограничение доставки морфолино ограничивает применение этого метода и не позволяет использовать анализ успешноч, как анализ ЭРГ, что потребует глобальной оценки сетчатки. Следует отметить, что, как и любой эксперимент морфолино, желательно, чтобы подтвердить результаты, используя во-вторых, неперекрывающихся морфолино к целевой мРНК. В некоторых случаях можно также electroporate два разных morpholinos одновременно нокдаун выражения двух разных белков. Мы продемонстрировали это, сбивая выражение как Pax6a и Pax6b белков, по отдельности и в комбинации 18.
Хотя мы продемонстрировали использование этой техники с нашей легкой модель повреждений, он, вероятно, может быть использован для изучения регенерации и в других моделях повреждения 2-8 или использоваться для изучения функции белков в неповрежденных сетчатки. Например, электропорации morpholinos могут быть использованы для нокдауна экспрессии специфических каналов или молекул сигнала в ганглии или amacrine клетки и затем изучать функции этих сигнализациипутей в визуальной обработке. Однако, как morpholinos влияют только на перевод новых белков, можно было бы ждать, пока эндогенный оборот белка происходит до анализа может быть выполнена. В зависимости от стабильности белков, которые могут варьироваться от нескольких часов до нескольких дней 18.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Жизнь Freimann научный центр и центр для сотрудников исследований данио рерио для их ухода и содержания рыбок данио.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 14095 | Any #5 tweezers with work |
Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments | Blade: 500314 Handle: 500317 |
|
Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton company | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 |
Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |