Summary
Метод условно нокдаун выражения целевого белка в сетчатку взрослых данио описывается, в котором участвуют intravitreally инъекционных антисмысловых morpholinos и electroporating их на сетчатке. В результате белок сбил в течение нескольких дней, что позволяет тестировать роль белка в регенерирующих или нетронутой сетчатку.
Protocol
1. Морфолино подготовки:
- Все морфолино олигонуклеотидов должно быть по заказу и заказать через GeneTools (человек, любящий учиться, OR). Мы используем положительно заряженных lissamine с метками morpholinos ездить электропорации morpholinos к отрицательному электроду. Мы пытались, но безуспешно, к целевой отрицательно заряженные флуоресцеина с метками morpholinos к положительному электроду помощью этой техники. Развести 300 нмоль морфолино в 100 мкл нуклеазы без воды, получая 3 мМ раствора. Алиготе морфолино на несколько парафин уплотнением труб микроцентрифужных. Хранить вдали от света месте при комнатной температуре.
- Определить концентрацию морфолино путем разбавления 5 мкл морфолино (или воды, используемой для разбавления морфолино как пустой) в 95 мкл 0,1 N HCl. Установите спектрофотометр длин волн (λ) до 265 нм. Вычислить постоянную для вашего морфолино по следующей формуле:
Постоянное = молекулярная масса частности к морфолин° Х 1000/molar абсорбции. - Вы увидите, молекулярной массы и молярного поглощения данных на "Oligo Свойства" лист поставляется с каждым морфолино. Анализ пустым, чтобы проверить базовые показания и снять показания каждого разведенного морфолино. Умножить абсорбции при 265 нм каждого морфолино ее определяется постоянным и на фактор разведения, чтобы получить концентрации в нг / мкл. Разделите это число на молекулярный вес, чтобы определить концентрацию в мМ. Развести морфолино, при необходимости, рабочей концентрации.
2. Удалите внешние рогового слоя:
- Обезболить 6-12 месяца данио взрослого в Tricaine или 2-феноксиэтанол на уровне 1,0 мг / мл в резервуар для воды рыбок данио.
- Оберните данио в смоченным кусок бумажного полотенца, охватывающих жабры, но оставив глаз подвергается. Завернутые рыба находится под стереоскоп и увеличением увеличивается до диаметра глаз заполняет примерно одну третьполя зрения (рис. 1).
- Использование Дюмон # 5 пинцетов, захват наружной роговицы у глазной щели. Эта ткань окрашивается в красный и называется "OC" на рисунке 1. Существует небольшой выступ или губу, указанном стрелкой с надписью "CL". Потяните под небольшим углом (т.е. 10 градусов) через глаз, чтобы удалить внешнюю роговицы. С практикой, это может быть завершена в одно движение. Если скольжение пинцетом, повторно захватить ткани и снова тянуть под небольшим углом пока не будет удален. Хорошо прилагается роговицы может привести к глазу кажется выбили из розетки, когда вытащил. Вы можете держать глаза становились вытесняют стабилизирующее с другим набором пинцетом.
3. Роговицы разрез и морфолино инъекций:
- Сразу же после удаления наружной роговицы, делают небольшой разрез в роговице, где ученик отвечает радужной оболочки глаза (рис. 2). Это делается с помощью сапфира лезвие скальпеля (См. материалы).
- Нагрузка 0,5 мкл раствора 3,0 мМ морфолино в Hamiltна шприц оснащен 33 калибр съемные, тупой конец иглы (См. материалы). Внесите вверх и вниз для удаления пузырьков воздуха в линию. Осторожно вставьте иглу в стекловидное тело через разрез (рис. 2). Не вставляйте иглу слишком далеко, или вы прокол сетчатки или вытеснять линзы.
- Медленно вводят раствор морфолино в vitreal пространства. В зависимости от возраста рыбы, vitreal пространства проведет ~ 0,5 мкл. Вы должны визуализировать неокрашенного стекловидного утечки из разреза, как это, перемещенных в результате решения морфолино. Inject пока небольшое количество утечек морфолино решение из разреза. Вы должны четко визуализировать lissamine с метками морфолино внутри глаза.
- После инъекции, вернуть рыбу в аквариум, чтобы оправиться. Мы обычно только колют левый глаз, с помощью правого глаза, как uninjected контроля, но электропорации обоими глазами возможно.
4. Электропорация:
- Следующийвведение около 10 рыб, повторно анестезию вводили рыбу и завернуть его в смоченную кусок бумажного полотенца, просто покрытие жабры, но оставив глаз подвергается. Передача рыбы чашки Петри. Положите на латекс или аналогичные перчатки, чтобы избежать контакта с анестезией. Хотя мягко проведения рыбу на дно блюдо, залейте блюдо с анестезией (рис. 3, слева).
- 3-мм диаметра электрода платиновой пластины (см. материалы) локализует электропорации импульсов примерно половина сетчатки. Как правило, мы целевой спинной сетчатки. Аккуратно нажмите положительного электрода вниз по вентральной половине глаза. С наружной роговицы удалены, глаз легко поворачивается, выставляя спинной части глазного яблока.
- Хотя по-прежнему давит на брюшной стороне глаза, место отрицательного электрода вблизи (~ 1 - 2 мм) подвергается спинной половине глаз. Будьте осторожны, не прикасайтесь к отрицательному электроду непосредственно на глаза, что приведет к повреждениюспинной сетчатки. После определения соответствующего расстояния между электродами, используйте регулировочный винт на ручке электродов утверждать, что распространяются, когда electroporating. Это сохраняет отрицательный электрод оптимальное расстояние от глаз, когда положительный электрод нажата в нужном положении.
- Electroporate глаза, используя CUY21 площади волна Electroporator (См. материалы). Электропорация параметры должны быть установлены в двух последовательных 50-мс импульсов, при 75 В с 1-сек паузы между импульсами.
- Возвращение рыбы в бак. Как правило, мы начинаем наш протокол для постоянного светоиндуцированного дегенерации сетчатки сразу после электропорации.
5. Представитель результаты:
- За 3-5 дней после электропорации (в зависимости от стабильности морфолино), lissamine метка может быть представлена во всех слоях сетчатки в секционного сетчатки (рис. 4). Это служит подтверждением наличияпомечены морфолино.
- Мы можем добиться полного нокдаун белка до 3-5 дней после электропорации, в зависимости от эффективности морфолино (рис. 5). Как правило, во время исследования лечение светом, жмем глаза на 3 или 4 дня после электропорации морфолино. Это можно сделать, удалив весь глаз с Дюмон # 5B пинцет с загнутыми концами (рис. 6, материалов) и обработка ткани для иммуногистохимии 15. Как и в любой нокдаун техники, демонстрация эффективных нокдаун должны быть указаны в целях подтверждения фенотипа. Поэтому мы предлагаем получение антисыворотки для белок. Или же, если и антитела не доступен и морфолино направлена либо акцептором соединения или донорской зоны в пре-мРНК, он будет блокировать эффективные сплайсинга мРНК. В этом случае, можно использовать обратной транскриптазы-PCR для усиления фланговые последовательности в morphant РНК и определить эффективность блокирования нормальной splicING шаблону.
- Когда сетчатки подразделяются из носовой временным на спинном вентральной оси, затененные синие коробки (рис. 6) представляет областей сетчатки, которые наиболее часто повреждаются из электропорации само событие. Затененных розовые окна представляет собой область, которая предназначена для морфолино введения в клетки сетчатки от электропорации.
Рисунок 1. Схема изображением удаления эпителиального слоя роговицы. Левая панель показывает основные особенности строения глаза, в том числе линза (L), стекловидное (Vit), сетчатки (R), наружной роговицы (OC), внутренняя роговица (IC) и роговицы выступ ( CL). Ориентация глаз показан в правом нижнем углу первой панели и помечена передних (А), задний (Р), спинной (D), и вентральной (V). Красный цвет указывает наружной роговицы, что удаляется. Вторая кастрюля эль показывает, как щипцы используются для понимания роговицы выступ и потянуть наружной роговицы через глаза под небольшим углом (третья панель). Правая панель показывает, как вторая пара щипцов может быть использован для устойчивого глаз, потянув роговицы.
Рисунок 2. Схема этапов интравитреальные инъекции морфолино. Маленький разрез сделан в глаза, где ученик отвечает диафрагмы (левая панель). В результате разрыва должна быть достаточно большой для 33 иглу, которая заполнена решение морфолино, для вставки (в центре панели). Медленно вводят 0,5 мкл раствора в стекловидное тело (правая панель). Вы должны визуализировать небольшое количество vitreal решение выйти из разреза в качестве стекловидного частично заменены с lissamine с метками морфолино (правая панель).
ig3.jpg "/>
Рисунок 3. Схема общая процедура электропорации. Наркоза рыбу, которая была intravitreally вводили морфолино, мягко, завернутые в влажным бумажным полотенцем (левая панель). Бумажное полотенце должно охватывать жабры, но не препятствуют глаз (средняя часть). Аккуратно нажмите положительного электрода вниз на вентральной части глаза, позволяя спинной половине глаз, чтобы повернуть из розетки. Место отрицательного электрода около 1 мм от дорзальной половины глаза и начать электропорации (правая панель).
Рисунок 4. Конфокальной образ сравнения сетчатки электропорации без intravitreally инъекционных lissamine с метками морфолино (), и сетчатка intravitreally инъекции и электропорации с lissamine с метками морфолино (B). Этикетке lissamine встречается во всех слоях сетчатки и клеточных типов. АФК, стержнем внешнейсегментов; ONL, наружный ядерный слой; INL, внутренний ядерный слой; GCL, слой ганглиозных клеток.
Рисунок 5. Конфокальной изображений сравнения PCNA immunolocalization в сетчатке электропорации с контролем морфолино (левая панель) и сетчатки электропорации с анти-PCNA морфолино (правая панель) до светоиндуцированного смерть клетки фоторецепторов. Темно-адаптированных взрослых белых рыбок данио были помещены в постоянную интенсивного света в течение 1, 2 или 3 дня после электропорации морфолино. Контроль морфолино не удалось подавить увеличение PCNA выражение в свет поврежденной сетчатки. Анти-PCNA морфолино эффективно сбил PCNA экспрессии белка через три дня постоянной интенсивной причинение легкого.
Рисунок 6. Схема (слева) показывает энуклеация глаза для рrocessing и cryosectioning, что делается вдоль спинной вентральной оси. Розовый затененное окно (справа) показывает, сетчатки регион с наибольшим количеством белка нокдаун помощью этой техники. Синий затененные окна представляют собой области, которые наиболее часто повреждены электропорации события. Ориентация глаз помечены передних (А), задний (Р), спинной (D), и вентральной (V).
Discussion
Недавно два микрочипов анализа рассмотрены экспрессии генов изменения, которые произошли во время регенерации или светового повреждения сетчатки или хирургически-вырезали сетчатки патч 10, 16. Оба исследования показали многочисленные гены, которые выставляются значительные изменения в выражении, увеличения или уменьшения, которые, вероятно, требуются для различных событий, которые происходят во время регенерации сетчатки, таких как вхождение в атмосферу глии Мюллера в клеточный цикл, продолжающийся пролиферацию и миграцию нейронов прародителей к поврежденной сетчатки слой, и дифференциация нейронов прародителей в правильный тип нейронов клетки. Хотя прямое сравнение этих двух наборов данных микрочипов выявить гены-кандидаты, которые могут быть задействованы в этих клеточных событий, в конечном счете этих генов и их белков закодированы должна быть проверена, чтобы определить, если они необходимы для регенерации нейронов. Здесь мы описываем мощный потерей функции подход к conditioНаконец нокдаун белков интереса к взрослой сетчатке рыбок данио. Эта техника была использована для изучения как вне-и внутриклеточных белков, а также сигнальные молекулы, факторы транскрипции и белков, необходимых для репликации ДНК 17-19. Таким образом, этот метод в значительной степени способствовал нашему пониманию молекулярного механизма, лежащего взрослого регенерации сетчатки в рыбок данио.
Мы протестировали несколько параметров электропорации (напряжения, число импульсов, время между импульсами), прежде чем успешным протокола была достигнута. Предыдущий доклад electroporating morpholinos в плавнике регенерирующим данио хвостового использовали 10 импульсов на низкое напряжение (15 В) 20. Потому что взрослые сетчатки данио окружен несколькими слоями клеток и не является легко доступным для пинцет электродов, параметры, используемые в плавнике были неудачны на эффективное electroporating morpholinos во взрослую сетчатки. И наоборот, высокое напряжение (100 В) часто разрешениемulted в смерти рыбы. Недавно, 5 импульсов 80 V был описан в electroporate плазмиды ДНК в новорожденной мыши щенка сетчатки 21. Мы обнаружили, что чуть менее интенсивным 2 импульсы 75 В в результате успешной электропорации morpholinos во взрослую сетчатки данио с выживанием в размере 100% обработанных рыбы. Кроме того, мы обнаружили, что удаление внешнего большинство (или внешнего большинство) компонента роговице значительно увеличилось электропорации эффективности. Увеличение числа импульсов может устранить необходимость удаления этой ткани, но также может привести к большей повреждения тканей. Обширные исследования показали, что контроль этих параметров не вызывает никаких значительных гибели клеток сетчатки или изменить специфический клеточный ответ наблюдается при регенерации фоторецепторов 19. Gain-функции исследования в настоящее время не возможно при использовании этого метода в естественных условиях, из-за нашей неспособности последовательно electroporate большой рибонуклеиновых кислот во все тetinal клеток. Тем не менее, успех electroporating плазмид в сетчатке мышей в естественных условиях и рыбок данио сетчатки в эксплантатах предполагает, что это все еще возможно в 21 данио, 22.
Одна из сильных сторон этого метода является электропорация появляется эффективно внедрять морфолино во все различные типы клеток сетчатки. Тем не менее, одна потенциальная слабость в том, что электропорации эффективно доставлен в морфолино только спинной и центральной сетчатки регионах. Второе событие электропорации к вентральной половины сетчатки приводит к хорошей ориентации для всех слоев, но часто приводит к ее повреждению. Это пространственное ограничение вероятно, была из-за формы и размещения электродов. Использование специально разработанных чашки формы электродов, которые могут быть размещены вокруг глаз может улучшить эту слабость. Это пространственное ограничение доставки морфолино ограничивает применение этого метода и не позволяет использовать анализ успешноч, как анализ ЭРГ, что потребует глобальной оценки сетчатки. Следует отметить, что, как и любой эксперимент морфолино, желательно, чтобы подтвердить результаты, используя во-вторых, неперекрывающихся морфолино к целевой мРНК. В некоторых случаях можно также electroporate два разных morpholinos одновременно нокдаун выражения двух разных белков. Мы продемонстрировали это, сбивая выражение как Pax6a и Pax6b белков, по отдельности и в комбинации 18.
Хотя мы продемонстрировали использование этой техники с нашей легкой модель повреждений, он, вероятно, может быть использован для изучения регенерации и в других моделях повреждения 2-8 или использоваться для изучения функции белков в неповрежденных сетчатки. Например, электропорации morpholinos могут быть использованы для нокдауна экспрессии специфических каналов или молекул сигнала в ганглии или amacrine клетки и затем изучать функции этих сигнализациипутей в визуальной обработке. Однако, как morpholinos влияют только на перевод новых белков, можно было бы ждать, пока эндогенный оборот белка происходит до анализа может быть выполнена. В зависимости от стабильности белков, которые могут варьироваться от нескольких часов до нескольких дней 18.
Disclosures
Нам нечего раскрывать
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Жизнь Freimann научный центр и центр для сотрудников исследований данио рерио для их ухода и содержания рыбок данио.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
| 3-mm diameter paddle electrodes | Protech International, Inc. | CUY 650-P3 | |
| Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
| Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | Any #5 tweezers with work |
| Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments, Inc. | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
| Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments, Inc. | Blade: 500314 Handle: 500317 | |
| Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton Co | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 | Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |
References
- Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. J. Neurosci. 28, 1109-1117 (2008).
- Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
- Hitchcock, P., Ochocinska, M., Sieh, A., Otteson, D. Persistent and injury-induced neurogenesis in the vertebrate retina. Prog. Retin. Eye Res. 23, 183-194 (2004).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. B.M.C Dev. Biol. 6, 36-36 (2006).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).
- Wolburg, H. Time- and dose-dependent influence of ouabain on the ultrastructure of optic neurones. Cell Tissue Res. 164, 503-517 (1975).
- Wu, D. M., Schneiderman, T., Burgett, J., Gokhale, P., Barthel, L., Raymond, P. A. Cones regenerate from retinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 2115-2124 (2001).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish. Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).
- Kassen, S. C., Ramanan, V., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Liu, C. G., Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30, 198-200 (2001).
- London, C. A., Sekhon, H. S., Arora, V., Stein, D. A., Iversen, P. L., Devi, G. R. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10, 823-832 (2003).
- Thummel, R., Kassen, S. C., Enright, J. M., Nelson, C. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration. Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).
- Cameron, D. A., Gentile, K. L., Middleton, F. A., Yurco, P. Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina. Mol. Vis. 11, 775-791 (2005).
- Craig, S. E., Thummel, R., Ahmed, H., Vasta, G. R., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).
- Thummel, R., Enright, J. M., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Bailey, T. J., Hyde, D. R. Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration. Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).
- Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina. Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).
- Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 16-22 (2004).
- Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332, 195-209 (2008).
