有条件击倒在成年斑马鱼视网膜的目标蛋白质的表达,是一个方法,它涉及到玻璃体内注射反义morpholinos和电穿孔进入视网膜。由此产生的蛋白质是撞倒了好几天,这使得检测蛋白质的作用,在再生或完整的视网膜。
许多破坏性的遗传性眼疾造成逐步和不可逆转的失明,因为人类无法再生死亡或患病的视网膜神经细胞。相比之下,成年斑马鱼视网膜拥有强大的能力,自发地再生是在各种不同的视网膜损伤模型,包括视网膜穿刺术,化学消融,集中的高温,和强光治疗1-8失去任何神经类。我们的实验室广泛的特点不断强光处理后玻璃体内注射哇巴因2,5,9的内层视网膜神经元再生光感受器。在所有情况下,居民米勒的神经胶质细胞重新进入细胞周期的产生,这将继续增殖,迁移到适当的视网膜层,在那里他们不足的神经元分化的神经祖细胞。
我们的特点在五个不同阶段的光,DAMA再生GED视网膜特定的细胞反应突出。我们确定了在每个阶段的视网膜再生多个差异表达的基因,通过基因芯片分析 10 。这些基因中的许多人还眼发展的关键。为了测试每个候选基因/蛋白的作用,在视网膜再生的,我们需要制定一个有条件限制,只能在次候选人蛋白的表达,在成人视网膜再生的方法。
啉寡核苷酸被广泛用于研究特定蛋白质的功能丧失,在斑马鱼,爪蟾,鸡,鼠的发展,和人类异种移植肿瘤11-14。这些修改后的寡核苷酸碱基互补的RNA序列,以阻止靶RNA的剪接或翻译。 Morpholinos稳定在细胞中,可以消除或“击倒”为三至五年天12蛋白的表达。
在这里,我们描述了一个有效击倒目标在成年斑马鱼视网膜蛋白的表达方法。这种方法采用里沙明标记的反义,到成年斑马鱼眼玻璃体注射morpholinos。吗啉是利用电极钳,然后到背侧和中央视网膜的所有类型的细胞电穿孔。里沙明提供啉电击负责,并可以可视化评估的视网膜细胞啉的存在。
有条件击倒在视网膜上可以用来研究在再生过程中的不同时间的特定蛋白质的作用。此外,这种方法可用于研究二阶神经元的视觉传导和视觉处理等过程中的特定蛋白质,在未损坏的视网膜中的作用。
最近,两个芯片分析研究基因表达的变化发生在光受损的视网膜,或手术切除视网膜修补10,16再生。这两项研究显示,展出众多的基因表达显著变化,增加或减少,这可能是针对不同的事件发生在视网膜再生的,如米勒胶质细胞重新进入细胞周期进入,要求,继续增殖和迁移神经祖细胞受损的视网膜层,并到正确的神经细胞类型的神经祖细胞的分化。虽然这两个芯片的数据集的直接比较,揭示候选人在这些细胞的活动可能涉及的基因,这些基因及其编码的蛋白质最终必须进行测试,以确定它们是否是必要的神经再生。在这里,我们描述了一个强大的丧失功能的方法来conditio成年斑马鱼视网膜的利益应受击倒的蛋白质。这项技术已用于研究外和细胞内的蛋白质,以及信号分子,转录因子和DNA 复制 17-19所需的蛋白质。因此,这种方法有很大的帮助我们基本在斑马鱼成人视网膜再生的分子机制的理解。
我们测试了多个电参数(电压,脉冲数,脉冲之间的时间)前取得一个成功的协议。一个以前的报告中使用的电穿孔进入再生斑马鱼尾鳍morpholinos在低电压(15 V) 的 20 10个脉冲。因为成年斑马鱼视网膜是由多个细胞层包围,不容易接触到镊子电极,在鱼翅中所使用的参数是不成功的,在有效地进入成人视网膜电穿孔morpholinos。相反,高电压(100伏)经常水库ulted死亡的鱼。近日,5脉冲80 V的描述electroporate 21小狗新生小鼠视网膜质粒DNA。我们发现,略少激烈2脉冲75 V的morpholinos成功电击到100%经处理后的鱼的生存与成年斑马鱼视网膜。此外,我们发现,去除最外面的(或最外部的)角膜组件,大大提高了电穿孔效率。增加脉冲数,可以消除消除这个组织的需要,但也可能导致更大的组织损伤。广泛的控制的研究表明,这些参数没有造成任何显著的视网膜细胞死亡或改变在感光再生 19中观察到的特定的细胞反应。增益功能的研究是目前无法使用这种技术在体内 ,由于我们无法一贯electroporate所有R大型核糖核酸etinal细胞。然而, 在植体内和斑马鱼视网膜的小鼠视网膜质粒电穿孔进入的成功表明,它仍然是一个在斑马鱼 21, 22的可能性。
这项技术的优势之一是电击出现,有效地引入不同的视网膜细胞类型的吗啉。然而,一个潜在的弱点,电击有效地传递到只有背和视网膜中央区域啉。朝着良好的目标是在所有图层的视网膜结果腹半的第二次电击事件,但往往损害结果。这种空间的限制,可能是由于电极的形状和位置。定制设计的杯形电极,可放在眼部周围的使用可能会改善这一弱点。这啉交付空间的限制使用这种技术,并排除使用检测SUCERG的分析h的,就需要一个全球评估的视网膜。应该指出的是,与任何啉实验,最好是确认你的结果,使用第二个,非重叠啉靶mRNA。在某些情况下,很可能也electroporate两个不同的morpholinos同时击倒了两个不同的蛋白质表达。我们证明撞倒的Pax6a和Pax6b蛋白质的表达,单独和组合 18这一点。
虽然我们展示了使用这种技术,我们的光损伤模型,它可能可以用来研究其他损伤模型2-8再生或用于研究蛋白质的功能完好的视网膜。例如,morpholinos电击可以用来击倒的具体通道或在神经节或无长突细胞的信号转导分子的表达,然后研究这些信号的功能在视觉处理的途径。然而,作为morpholinos只影响新的蛋白质的翻译,必须要等到发生内源性蛋白质周转才可以执行一个试验。根据蛋白的稳定性,范围可以从几个小时到天18。
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢的关心和维护斑马鱼斑马鱼研究人员Freimann生命科学中心和中心。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 14095 | Any #5 tweezers with work |
Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments | Blade: 500314 Handle: 500317 |
|
Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton company | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 |
Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |