Summary
Eine Methode, bedingt Knockdown ein Zielprotein Ausdruck in der erwachsenen Zebrafisch Retina beschrieben, das geht intravitreal Injektion antisense Morpholinos und Elektroporation sie in der Netzhaut. Das resultierende Protein ist für mehrere Tage, die Prüfung des Proteins Rolle bei der Regeneration oder intakten Netzhaut ermöglicht klopfte.
Abstract
Viele verheerende erbliche Augenerkrankungen führen progressive, irreversible Blindheit, weil die Menschen nicht mehr regenerieren kann sterben oder krank Netzhautneuronen. Im Gegensatz dazu besitzt die erwachsenen Zebrafisch Retina die robuste Fähigkeit, spontan regenerieren jede neuronale Klasse, die in einer Vielzahl von verschiedenen Netzhauterkrankungen Modelle, einschließlich der Netzhaut Punktion, chemische Ablation, konzentriert hohen Temperaturen und intensive Licht-Behandlung 1-8 verloren. Unser Labor ausgiebig Regeneration der Photorezeptoren folgenden konstant intensive Licht-Behandlung und der inneren Netzhaut-Neuronen nach intravitrealen Ouabain Injektion 2, 5, 9 aus. In allen Fällen, wohnhaft Müller Gliazellen wieder in den Zellzyklus zu neuronalen Vorläuferzellen, die sich zu vermehren und auf die richtige Netzhaut, wo sie differenzieren sich in der mangelhaften Neuronen wandern weiter zu produzieren.
Wir charakterisiert fünf verschiedenen Stadien während der Regeneration der Licht-damaged Netzhaut, die durch spezifische zelluläre Reaktionen hervorgehoben wurden. Wir identifizierten mehrere differentiell exprimierte Gene in jeder Phase des retinalen Regeneration durch mRNA-Microarray-Analyse 10. Viele dieser Gene sind auch entscheidend für okuläre Entwicklung. Um zu testen, die Rolle der einzelnen Kandidaten-Gen / Protein während Netzhaut Regeneration, mussten wir eine Methode zur bedingten Begrenzung der Ausdruck eines Kandidaten-Protein nur in Zeiten der Regeneration der erwachsenen Retina entwickeln.
Morpholino-Oligos sind weit verbreitet, um den Verlust der Funktion der Proteine während der Entwicklung von Zebrafisch, Xenopus, chick, Maus zu studieren, und Tumore in menschlichen Xenotransplantate 11-14. Diese modifizierten Oligos Basenpaar mit komplementären RNA-Sequenz zu blockieren das Spleißen oder Translation der Ziel-RNA. Morpholinos werden in der Zelle stabil und können beseitigt oder "Knockdown"-Protein-Expression für drei vor fünf Tagen 12.
Hier,beschreiben wir eine Methode zur effizienten Knockdown Expression des Zielproteins in der erwachsenen Zebrafisch Retina. Dieses Verfahren verwendet Lissamin-markierten antisense Morpholinos, dass in den Glaskörper des erwachsenen Zebrafisch Auge injiziert werden. Mit Elektrode Pinzette ist das Morpholino dann in alle Zelltypen des dorsalen und zentralen Netzhaut elektroporiert. Lissamine bietet die Ladung auf dem Morpholino für die Elektroporation und visualisiert werden können, um die Anwesenheit der Morpholino in die Zellen der Netzhaut zu beurteilen.
Bedingte Knockdown in der Netzhaut kann verwendet werden, um die Rolle von spezifischen Proteinen zu verschiedenen Zeiten während der Regeneration zu untersuchen. Darüber hinaus kann dieser Ansatz verwendet, um die Rolle von spezifischen Proteinen in der unbeschädigten Netzhaut, in solche Prozesse wie visuelle Signaltransduktion und visuelle Verarbeitung in Neuronen zweiter Ordnung zu studieren.
Protocol
1. Morpholino Zubereitung:
- Alle Morpholino-Oligos sollten individuell gestaltet und bestellt durch GeneTools (Philomath, OR). Wir verwenden die positiv geladenen Lissamin-tagged Morpholinos der Elektroporation Morpholinos in Richtung der negativen Elektrode zu fahren. Wir versuchten vergeblich, negativ geladene Fluorescein-markierten Morpholinos zur positiven Elektrode mit dieser Technik Ziel. Verdünnen Sie 300 nmol der Morpholino in 100 pl Nuklease-freies Wasser zu einer 3 mM Lösung zu erhalten. Aliquot der Morpholino in mehrere Paraffin versiegelt Mikrozentrifugenröhrchen. Getrennt von Licht bei Raumtemperatur.
- Bestimmen Sie die Morpholino-Konzentration durch Verdünnen von 5 ul der Morpholino (oder Wasser verwendet werden, um die Morpholino als leere verdünnt) in 95 ul 0,1 N HCl. Stellen Sie die Spektralphotometer Wellenlängen (λ) bis 265 nm liegt. Berechnen Sie die Konstante für Ihre Morpholino mit folgender Gleichung:
Constant = Molekulargewicht insbesondere Ihre morpholino X 1000/molar Absorption. - Sie werden das Molekulargewicht und die molare Extinktion Daten auf dem "Oligo Properties" Blatt mit jeweils Morpholino erhalten haben. Analysieren Sie die leere zum Ausgangswert Lesungen zu überprüfen und zu Lesungen der verdünnten Morpholino. Multiplizieren Sie die Absorption bei 265 nm von jedem Morpholino durch seine bestimmte Konstante und mit dem Verdünnungsfaktor, um die Konzentration in ng / ul erhalten. Teilen Sie diese Zahl durch das Molekulargewicht und der Konzentration in mM bestimmen. Verdünnen Sie die Morpholino, falls erforderlich, auf eine Arbeitskonzentration.
2. Entfernen Sie die äußere Schicht der Hornhaut:
- Anesthetize 6-12 Monate alten erwachsenen Zebrafisch in Tricaine oder 2-Phenoxyethanol bei 1,0 mg / ml in Zebrafisch-Tank Wasser.
- Wrap Zebrafisch in einem feuchten Stück Küchenpapier, für die Kiemen, sondern verlassen das Auge ausgesetzt. Die umwickelten Fisch ist unter einem Stereoskop platziert und die Vergrößerung wird erhöht, bis der Durchmesser des Auges füllt etwa ein Drittel derdes Gesichtsfeldes (Abbildung 1).
- Mit Dumont Nr. 5 Pinzette greifen die äußeren Hornhaut in der Nähe der Augenspalte. Dieses Gewebe wird in roter Farbe und der Aufschrift "OC" in Abbildung 1. Es gibt einen leichten Vorsprung oder Lippe durch den Pfeil mit der Aufschrift "CL" angezeigt. Ziehen Sie in einem flachen Winkel (zB 10 Grad) über das Auge auf die äußere Hornhaut zu entfernen. Mit der Praxis kann dies in einer Bewegung abgeschlossen sein. Wenn der Pinzette rutschen, wieder greifen das Gewebe wieder in einem flachen Winkel ziehen, bis entfernt. Ein gut befestigt Hornhaut kann das Auge aus der Steckdose verdrängt werden, wenn gezogen wird. Sie können das Auge davor verdrängt durch Verstetigung mit einem anderen Satz von Pinzetten zu halten.
3. Hornhautschnitt und Morpholino-Injektion:
- Unmittelbar nach dem Entfernen der äußeren Hornhaut, machen einen kleinen Schnitt in der Hornhaut, wo die Schüler erfüllt die Iris (Abbildung 2). Dies geschieht mit Hilfe einer Saphir-Skalpell (siehe Materialien).
- Last 0,5 ul des 3,0 mM Morpholino-Lösung in eine Hamiltauf Spritze mit einer 33-Gauge abnehmbar, blunt-end-Nadel (siehe auch Material) ausgestattet. Pipette auf und ab, um Luftblasen in der Leitung zu entfernen. Schieben Sie die Nadel in den Glaskörper durch den Schnitt (Abbildung 2). Setzen Sie die Nadel zu weit, oder Sie werden Löcher in die Netzhaut oder verdrängen die Linse.
- Spritzen Sie das Morpholino-Lösung in den Glaskörper Raum. Je nach Alter der Fische wird die Glaskörper Raum halten ~ 0,5 pl. Sie sollten visualisieren ungefärbte Glaskörper ein Auslaufen des Einschnitts, wie sie von der Morpholino-Lösung versetzt wird. Inject, bis eine kleine Menge von Morpholino-Lösung tritt aus dem Schnitt. Sie sollten deutlich sichtbar die Lissamin-tagged Morpholino im Inneren des Auges.
- Nach der Injektion Rückkehr der Fische in den Tank zu erholen. Wir in der Regel nur zu injizieren dem linken Auge, mit dem rechten Auge als injizierten Kontrolle, aber die Elektroporation von beiden Augen möglich ist.
4. Elektroporation:
- Folgendedie Injektion von etwa 10 Fisch-, re-betäuben einer injizierten Fische und wickeln Sie es in ein feuchtes Stück Küchenpapier, nur für die Kiemen, sondern verlassen das Auge ausgesetzt. Übertragen Sie die Fische in eine Petrischale. Setzen Sie auf Latex oder ähnliche Handschuhe, um Kontakt mit der Narkose zu vermeiden. Während sanft Halten der Fische auf den Boden der Schale, füllen Sie die Schale mit Anästhesie (Abbildung 3, links).
- Ein 3-mm-Durchmesser Platinplatte Elektrode (siehe Materialien) lokalisiert die Elektroporation Impulse etwa die Hälfte der Netzhaut. Wir typischerweise Ziel der dorsalen Retina. Drücken Sie vorsichtig die positive Elektrode nach unten auf der ventralen Hälfte des Auges. Mit der äußeren Hornhaut entfernt, ist das Auge leicht gedreht, Freilegung der dorsale Teil des Augapfels.
- Während noch nach unten drücken auf der Bauchseite des Auges, statt der negativen Elektrode in der Nähe (~ 1 bis 2 mm) der exponierten dorsalen Hälfte des Auges. Achten Sie darauf, nicht auf die negative Elektrode direkt zu berühren, um das Auge, das wird in schädlichen Ergebnisder dorsalen Retina. Sobald Sie den richtigen Abstand zwischen den Elektroden zu ermitteln, verwenden Sie die Stellschraube am Griff der Elektroden an, dass Ausbreitung zu halten, wenn Elektroporation. Dies hält die negative Elektrode einen optimalen Abstand vom Augapfel, wenn die positive Elektrode unten in Position gedrückt.
- Elektroporieren das Auge mit einem CUY21 Square Wave Electroporator (siehe Materialien). Die Elektroporation Parameter sollten auf zwei aufeinander folgende 50-ms Impulse gesetzt werden, bei 75 V mit einem 1-Sekunden-Pause zwischen den Impulsen.
- Zurück Fische in den Tank. Wir beginnen normalerweise unser Protokoll für konstantes Licht-induzierten Netzhautdegeneration unmittelbar nach der Elektroporation.
5. Repräsentative Ergebnisse:
- Für 3-5 Tage nach der Elektroporation (abhängig von der Stabilität der Morpholino), kann die Lissamin Label visualisiert werden in allen Netzhautschichten in einer geschnittenen Netzhaut (Abbildung 4). Dieses dient als Bestätigung für das Vorhandensein vonder markierten Morpholino.
- Wir können voller Protein Knockdown von bis zu 3-5 Tage nach der Elektroporation zu erreichen, abhängig von der Wirksamkeit der Morpholino (Abb. 5). In der Regel während der Licht-Therapiestudien ernten wir die Augen auf 3 oder 4 Tage nach Morpholino Elektroporation. Und Verarbeitung des Gewebes für die Immunhistochemie 15; Dies wird durch Entfernen des gesamten Auges mit Dumont # 5B Zange mit gebogenen Enden (Materials Abbildung 6) durchgeführt. Wie bei jedem Knockdown-Technik, muss eine Demonstration effizienter Knockdown gezeigt, um den Phänotyp zu bestätigen. Daher empfehlen wir den Erhalt Antiseren für Ihr Protein von Interesse. Alternativ, wenn und Antikörper nicht zur Verfügung steht und die Morpholino darauf gerichtet, die Spleiß-Akzeptor oder Donator Ort in der prä-mRNA entweder, blockiert effizientes Spleißen der mRNA. In diesem Fall ist es möglich, Reverse-Transkriptase-PCR verwenden, um die flankierenden Sequenzen in der morphant RNA-Amplifikation und bestimmen die Effizienz der Blockierung der normalen splicIng. Muster.
- Wenn die Netzhaut geschnitten aus Nase, um die zeitliche auf der dorsalen ventralen Achse sind, stellen die schraffierten blauen Feldern (Abbildung 6) die Bereiche der Netzhaut, die meist aus der Elektroporation Veranstaltung selbst sind beschädigt. Die schattierten rosa Box stellt den Bereich, der für Morpholino Einführung in Netzhautzellen durch die Elektroporation ausgerichtet ist.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Entfernung der epithelialen Schichten der Hornhaut. Die linke Tafel zeigt die wichtigsten strukturellen Merkmale des Auges, einschließlich der Linse (L), der Glaskörper (Vit), der Netzhaut (R), der äußeren Hornhaut (OC), die innere Hornhaut (IC) und die Hornhaut Vorsprung ( CL). Die Orientierung des Auges ist in der unteren rechten Ecke des ersten Panel dargestellt und beschriftet anterior (A), posterior (P), dorsal (D) und ventralen (V). Die rote Färbung zeigt die äußere Hornhaut wird entfernt. Die zweite Pfanne el zeigt, wie die Zange verwendet werden, um die Hornhaut Vorsprungs zu erfassen und die äußeren Hornhaut in das Auge ziehen in einem flachen Winkel (dritter Teil). Das rechte Bild zeigt, wie eine zweite Zange zu stabilisieren das Auge eingesetzt werden können, während Sie den Hornhaut.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Schritte in die intravitreale Injektion von Morpholino beteiligt. Durch einen kleinen Schnitt in das Auge, wo der Schüler erfüllt die Iris (linkes Bild) gemacht. Die entstandene Lücke sollte gerade groß genug für eine 33-Gauge-Nadel, die mit dem Morpholino-Lösung eingesetzt werden soll (Mitte) gefüllt ist. Langsam injizieren 0,5 ul-Lösung in den Glaskörper (rechtes Bild). Sie sollten visualisieren eine kleine Menge von Glaskörper-Lösung aus dem Einschnitt kommen, wie der Glaskörper wird teilweise durch mit Morpholino (rechtes Bild) Lissamin-Tag ersetzt.
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Abbildung 3. Schematische Darstellung des allgemeinen Elektroporation Verfahren. Die betäubten Fische, die intravitreal mit dem Morpholino injiziert wurde, wird sanft in feuchten Papiertuch (links) gewickelt. Das Papiertuch sollte sich auf die Kiemen, aber nicht behindern das Auge (Mitte). Drücken Sie vorsichtig die positive Elektrode auf den ventralen Teil des Auges, so dass die dorsale Hälfte des Auges zu drehen aus der Steckdose. Legen Sie die negative Elektrode ca. 1 mm von der dorsalen Hälfte des Auges und starten Sie die Elektroporation (rechts).
Abbildung 4. Confocal image Vergleich einer Netzhaut ohne intravitreal Injektion eines Lissamin-tagged Morpholino (A) und einer Netzhaut intravitreal einschleusen und mit den Lissamin-tagged Morpholino (B) elektroporiert elektroporiert. Die Lissamin Label ist in allen Netzhautschichten und Zelltypen gefunden. ROS-, Stab äußerenSegmente; ONL, äußeren Körnerschicht; INL, innere Körnerschicht; GCL, Ganglienzellschicht.
Abbildung 5. Konfokalen Bildern verglichen PCNA Immunolokalisation in Netzhaut mit einem Kontroll-Mor (linkes Bild) und Netzhaut mit einem Anti-PCNA Morpholino (rechte Bilder) vor lichtinduzierten Absterbens der Sehzellen elektroporiert elektroporiert. Dark-angepasst erwachsene Albino Zebrafisch wurden in konstanten intensives Licht für 1, 2 oder 3 Tage nach der Elektroporation der Morpholino platziert. Die Steuerung Morpholino nicht erhöht PCNA-Expression in der Licht-geschädigten Netzhaut zu unterdrücken. Die anti-PCNA Morpholino effizient niedergeschlagen PCNA-Protein-Expression durch drei Tagen konstant intensive Licht führen.
Abbildung 6. Schaltplan (links) zeigt Enukleation des Auges für processing und Kryoschneiden, die entlang der dorsalen ventralen Achse erfolgt. Die rosa farbigen Feld (rechts) zeigt die Netzhaut Region mit der größten Menge an Protein Knockdown mit dieser Technik. Die blau unterlegten Kästen stellen Bereiche dar, die am häufigsten durch die Elektroporation Ereignis beschädigt sind. Die Orientierung des Auges ist anterior (A), posterior (P), dorsal (D) gekennzeichnet sind, und ventralen (V).
Discussion
Vor kurzem wurden zwei Microarray-Analysen der Veränderungen der Genexpression, die während der Regeneration der entweder das Licht geschädigte Netzhaut oder eine chirurgisch-herausgeschnitten Retina-Patch 10, 16 aufgetreten. Beide Studien ergaben zahlreiche Gene, die signifikante Veränderungen in der Expression zeigten, entweder steigend oder fallend, die wahrscheinlich für verschiedene Ereignisse, die während der Netzhaut Regeneration auftreten, wie re-entry der Müller Gliazellen in den Zellzyklus notwendig, weiterhin die Proliferation und Migration der neuronalen Vorläuferzellen, um die beschädigte Netzhaut, und die Differenzierung der neuronalen Vorläuferzellen in die richtige neuronalen Zelltyp. Während ein direkter Vergleich dieser beiden Microarray-Datensätze Kandidatengene, die in dieser zellulären Vorgänge beteiligt sein können, zeigen letztlich diese Gene und ihre kodierten Proteine muss daraufhin getestet, ob sie notwendig für die neuronale Regeneration sind. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige loss-of-function-Ansatz zur conditiointern Knockdown Proteine von Interesse in der erwachsenen Zebrafisch Retina. Diese Technik wurde verwendet, um sowohl extra-und intrazellulären Proteinen, sowie Signalmoleküle, Transkriptionsfaktoren und Proteine für die DNA-Replikation 17-19 erforderlich studieren. So hat diese Methode unser Verständnis des molekularen Mechanismus zugrunde liegenden erwachsenen Retina Regeneration im Zebrafisch unterstützt.
Wir testeten mehrere Elektroporation (Spannung, Anzahl der Impulse, Zeit zwischen den Impulsen), bevor eine erfolgreiche Protokoll wurde erreicht. Ein früherer Bericht der Elektroporation Morpholinos in die regenerierende Zebrafisch Schwanzflosse verwendet 10 Impulse bei einer niedrigen Spannung (15 V) 20. Da die erwachsenen Zebrafisch Retina durch mehrere Zellschichten umgeben ist und nicht leicht zugänglich Pinzette Elektroden wurden die Parameter in der Flosse verwendet bei effizienter Elektroporation Morpholinos in die Erwachsenenwelt Netzhaut erfolglos. Umgekehrt kann eine hohe Spannung (100 V) oft resulted in den Tod, um die Fische. Kürzlich, 5 Impulse von 80 V wurde beschrieben, um Plasmid-DNA in der neugeborenen Maus pup Netzhaut 21 elektroporieren. Wir fanden, dass ein etwas weniger intensiv 2 Impulse von 75 V in erfolgreiche Elektroporation des Morpholinos führte in die Erwachsenenwelt Zebrafisch Retina mit dem Überleben von 100% der behandelten Fische. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Entfernung der äußeren meisten (oder externen meisten) Komponente der Hornhaut stark erhöht die Elektroporation Effizienz. Die Erhöhung der Anzahl der Impulse kann die Notwendigkeit für Entfernung dieses Gewebes kann aber auch dazu führen, größere Gewebeschäden. Umfangreiche Kontroll-Studien zeigten, dass diese Parameter zu keinerlei signifikanten retinalen Zelltod oder ändern Sie die spezifische zelluläre Reaktionen während Photorezeptor Regeneration 19 beobachtet. Gain-of-function-Studien sind derzeit nicht möglich, mit dieser Technik in vivo, durch unsere Unfähigkeit, konsequent elektroporieren großen Ribonukleinsäuren in allen retinal Zellen. Allerdings schlägt der Erfolg der Elektroporation Plasmide in der Maus Netzhaut in vivo und der Zebrafisch Retina in Explantaten ist es immer noch eine Möglichkeit, in Zebrafisch-21, 22.
Eine der Stärken dieser Technik ist die Elektroporation scheint effizient einführen Morpholino in all den verschiedenen retinalen Zelltypen. Allerdings wurde eine mögliche Schwäche, die Elektroporation effizient lieferte die Morpholino nur in die dorsalen und zentralen Netzhaut Regionen. Eine zweite Elektroporation Veranstaltung auf die ventrale Hälfte der Netzhaut führt zu einer guten Ausrichtung auf alle Ebenen, sondern führt oft zu Schäden. Diese räumliche Beschränkung wahrscheinlich war aufgrund der Form und Platzierung der Elektroden. Der Einsatz von maßgeschneiderten becherförmigen Elektroden, die um das Auge gebracht werden konnte verbessern kann diese Schwäche. Diese räumliche Beschränkung der Morpholino Lieferung beschränkt die Verwendung dieser Technik und schließt die Verwendung eines Assays erfolgreichh als ERG-Analyse, dass eine umfassende Beurteilung der Netzhaut benötigen würde. Anzumerken ist, dass wie bei jedem Morpholino Experiment, ist es ratsam, Ihre Ergebnisse bestätigen die Verwendung eines zweiten, nicht-überlappenden Morpholino auf die Ziel-mRNA werden. In einigen Fällen ist es möglich, auch elektroporieren zwei verschiedene Morpholinos gleichzeitig knockdown die Expression von zwei verschiedenen Proteinen. Wir haben gezeigt, das durch Klopfen Sie den Ausdruck sowohl der Pax6a und Pax6b Proteine, einzeln und in Kombination 18.
Obwohl wir die Verwendung dieser Technik demonstriert mit unseren Licht-Schadensmodell, könnte es wahrscheinlich zur Regeneration in anderen Schäden Modelle 2-8 Studie werden oder verwendet werden, um die Funktion von Proteinen in der unbeschädigten Netzhaut zu untersuchen. Zum Beispiel könnte die Elektroporation von Morpholinos zum Knockdown die Expression bestimmter Kanäle oder Signaltransduktionsmoleküle in Ganglion oder Amakrinzellen werden und dann studieren die Funktion dieser SignalisierungWege in der visuellen Verarbeitung. Doch wie Morpholinos nur auf Übersetzung der neuen Protein, müsste man warten, bis endogenes Protein Umsatz erfolgt, bevor ein Test durchgeführt werden konnte. Je nach Stabilität des Proteins könnte, dass von Stunden auf Tage 18 Bereich.
Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei der Freimann Life Science Center und Center for Zebrafisch Wissenschaftliches Personal danken für ihre Pflege und Wartung der Zebrafisch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
| 3-mm diameter paddle electrodes | Protech International, Inc. | CUY 650-P3 | |
| Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
| Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | Any #5 tweezers with work |
| Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments, Inc. | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
| Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments, Inc. | Blade: 500314 Handle: 500317 | |
| Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton Co | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 | Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |
References
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