Morpholinos के vivo electroporation में वयस्क Zebrafish रेटिना में

Summary

एक सशर्त वयस्क zebrafish रेटिना में एक लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति पछाड़ना वर्णित विधि है, जो intravitreally antisense morpholinos इंजेक्शन लगाने और उन्हें रेटिना में electroporating शामिल है. परिणामस्वरूप प्रोटीन कई दिनों, जो regenerating या बरकरार रेटिना में प्रोटीन की भूमिका के परीक्षण की अनुमति देता है के लिए नीचे खटखटाया है.

Abstract

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment ^1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection ^{2, 5, 9}. In all cases, resident Müller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons.

We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis ¹⁰. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina.

Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts ^11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or “knockdown” protein expression for three to five days ¹².

Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells.

Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

Protocol

1. Morpholino तैयारी: सभी morpholino oligos कस्टम डिजाइन और GeneTools के माध्यम से आदेश दिया (Philomath, या) किया जाना चाहिए. हम सकारात्मक आरोप लगाया lissamine टैग morpholinos का उपयोग करने के लिए नकारात्मक इलेक्ट्रोड की ओर electroporated morpholinos ड्राइव. हमने कोशिश की, असफल, इस तकनीक का उपयोग करते हुए सकारात्मक इलेक्ट्रोड के लिए नकारात्मक – चार्ज fluorescein टैग morpholinos लक्ष्य. Nuclease मुक्त पानी के 100 μl में morpholino के 300 nmol पतला करने के लिए एक 3 मिमी समाधान उपज. एकाधिक आयल सील microcentrifuge ट्यूबों में morpholino अशेष भाजक. कमरे के तापमान पर प्रकाश से दूर स्टोर. 0.1 एन एचसीएल का 95 μl में morpholino (या करने के लिए के रूप में एक खाली morpholino पतला इस्तेमाल किया पानी) के 5 μl गिराए द्वारा morpholino एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (λ) तरंग दैर्ध्य 265 एनएम के लिए सेट. अपने morpholino के लिए निम्न समीकरण का उपयोग निरंतर गणना: लगातार = आणविक अपने morpholin के लिए विशेष रूप से वजनओ एक्स 1000/molar absorbance. आप "oligo गुण" प्रत्येक morpholino के साथ प्रदान की चादर पर आणविक वजन और दाढ़ absorbance डेटा मिलेगा. आधारभूत रीडिंग को सत्यापित करने और प्रत्येक पतला morpholino की रीडिंग ले रिक्त विश्लेषण. प्रत्येक morpholino के 265 एनएम पर अपने निर्धारित निरंतर और कमजोर पड़ने कारक द्वारा absorbance एनजी μl / एकाग्रता मिल गुणा. आणविक भार से इस संख्या में फूट डालो मिमी में एकाग्रता का निर्धारण. Morpholino एक काम एकाग्रता के लिए यदि आवश्यक हो, पतला. 2. बाहरी corneal परत निकालें: Anesthetize Tricaine या zebrafish टैंक पानी में 1.0 मिलीग्राम / मिलीलीटर में 2-phenoxyethanol में 6-12 महीने पुराने वयस्क zebrafish. लपेटें zebrafish में एक कागज तौलिया का टुकड़ा सिक्त, गहरे नाले को कवर, लेकिन छोड़ने आँख उजागर. लिपटे मछली त्रिविमदर्शी के तहत रखा गया है और बढ़ाई बढ़ जाती है जब तक आंखों के व्यास का लगभग एक तिहाई भरता हैदृश्य क्षेत्र (चित्रा 1). Dumont # 5 चिमटी का प्रयोग, ऑप्टिक विदर के पास बाहरी कॉर्निया को पकड़ो. इस ऊतक लाल रंग में रंग जाता है और चित्र 1 में "OC" लेबल है. वहाँ एक मामूली फलाव या होंठ "सीएल" लेबल तीर द्वारा संकेत है. आँख भर एक कम कोण (यानी 10 डिग्री) पर खींचो करने के लिए बाहरी कॉर्निया निकालने के लिए. अभ्यास के साथ, यह एक प्रस्ताव में पूरा किया जा सकता है. पर्ची यदि चिमटी, ऊतक फिर से हड़पने के लिए और फिर एक कम कोण पर पुल जब तक हटा दिया. एक अच्छी तरह से संलग्न कॉर्निया थैली से उखाड़ फेंकना जब खींचा पैदा कर सकता है. आप चिमटी का एक और सेट के साथ steadying से उखाड़ फेंकना बनने से नजर रख सकते हैं. 3. कॉर्नियल चीरा और morpholino इंजेक्शन: तुरंत बाहरी कॉर्निया को हटाने के बाद, कॉर्निया में एक छोटा सा चीरा जहाँ शिष्य परितारिका (चित्रा 2) मिलता है. यह एक नीलमणि ब्लेड स्केलपेल (सामग्री देखें) का उपयोग किया जाता है. Hamilt में 3.0 मिमी morpholino समाधान के 0.5 μl लोडसिरिंज पर एक 33 गेज हटाने योग्य, कुंद अंत सुई (सामग्री देखें) के साथ सुसज्जित है. ऊपर और नीचे पिपेट के लाइन में हवाई बुलबुले को दूर. ध्यान से शीशे में चीरा (चित्रा 2) के माध्यम से सुई डालने. सुई बहुत दूर या आप रेटिना पंचर डालने या लेंस विस्थापित मत करो. धीरे vitreal अंतरिक्ष में morpholino समाधान इंजेक्षन. मछली की उम्र पर निर्भर करता है, vitreal अंतरिक्ष ~ 0.5 μl का आयोजन करेगा. आप uncolored कांच का चीरा के बाहर लीक के रूप में यह morpholino समाधान द्वारा विस्थापित है कल्पना करना चाहिए. चीरा के बाहर morpholino समाधान लीक की एक छोटी राशि तक इंजेक्षन. आप स्पष्ट रूप से आंख के अंदर lissamine टैग morpholino कल्पना करना चाहिए. इंजेक्शन के बाद, ठीक करने के लिए टैंक के लिए मछली वापसी. हम आम तौर पर केवल बाईं आंख सुई, एक uninjected नियंत्रण के रूप में सही नज़र का उपयोग, लेकिन दोनों आंखों की electroporation संभव है. 4. Electroporation: निम्नलिखितमछली के लगभग 10 इंजेक्शन, एक इंजेक्शन मछली फिर anesthetize है और इसे कागज तौलिया का एक टुकड़ा सिक्त में लपेट, बस गहरे नाले को कवर, लेकिन छोड़ने आँख उजागर. एक पेट्री डिश में मछली स्थानांतरण. वनस्पतिक दूध या इसी तरह के दस्ताने पर रखो संज्ञाहरण के जोखिम से बचने के लिए. जबकि धीरे पकवान की तह तक मछली पकड़, संज्ञाहरण के साथ पकवान भरने की (चित्रा 3, बाएं पैनल). एक प्लैटिनम 3 मिमी व्यास की थाली इलेक्ट्रोड (सामग्री देखें) रेटिना के लगभग एक आधा electroporation दालों localizes है. हम आम तौर पर पृष्ठीय रेटिना लक्ष्य. धीरे सकारात्मक इलेक्ट्रोड आँख की वेंट्रल आधे पर नीचे प्रेस. के साथ बाहरी कॉर्निया हटाया, आंख आसानी से घुमाया नेत्रगोलक की पृष्ठीय भाग को उजागर. आँख के उजागर पृष्ठीय आधा – हालांकि अभी भी आंख की ventral पक्ष पर नीचे दबाने के पास नकारात्मक इलेक्ट्रोड (2 मिमी ~ 1) जगह. नहीं आँख नकारात्मक इलेक्ट्रोड सीधे स्पर्श सावधान रहो, जो हानिकारक में परिणाम होगापृष्ठीय रेटिना. एक बार जब आप इलेक्ट्रोड के बीच उचित दूरी तय, इलेक्ट्रोड की संभाल पर समायोजन पेंच का उपयोग करने के लिए जब electroporating कि प्रसार को बनाए रखने. यह नकारात्मक इलेक्ट्रोड नेत्रगोलक जब इलेक्ट्रोड सकारात्मक स्थिति में नीचे दबाया जाता है से एक इष्टतम दूरी रहती है. CUY21 स्क्वायर वेव Electroporator (सामग्री देखें) का उपयोग कर आँख Electroporate. electroporation मापदंडों लगातार दो 50-मिसे दालों दालों के बीच थामने 1-सेकंड के साथ 75 वी पर, सेट किया जाना चाहिए. मछली टैंक के लिए लौटें. हम आम तौर पर लगातार प्रकाश प्रेरित तुरंत electroporation के बाद रेटिना अध: पतन के लिए हमारी प्रोटोकॉल शुरू. 5. प्रतिनिधि परिणाम: Electroporation (morpholino की स्थिरता पर निर्भर करता है) के बाद 3-5 दिनों के लिए, lissamine लेबल के सभी एक sectioned रेटिना (चित्रा 4) में रेटिना परतों में visualized किया जा सकता है. यह पुष्टि की उपस्थिति के लिए एक के रूप में कार्य करता हैmorpholino लेबल. हम 3-5 दिनों के लिए पूर्ण प्रोटीन पछाड़ना electroporation निम्नलिखित morpholino (चित्रा 5) की प्रभावकारिता के आधार हासिल कर सकते हैं,. आमतौर पर, प्रकाश उपचार के अध्ययन के दौरान, हम morpholino electroporation के बाद 3 या 4 दिन में आंखों फसल. और immunohistochemistry 15 के लिए ऊतक प्रसंस्करण, यह घुमावदार समाप्त होता है (सामग्री चित्रा 6) के साथ Dumont # 5B संदंश के साथ पूरे आँख हटाने के द्वारा किया जाता है . किसी भी पछाड़ना तकनीक के साथ के रूप में, कुशल पछाड़ना के एक प्रदर्शन के क्रम में phenotype मान्य दिखाया जाना चाहिए. इसलिए, हम अपने हित के प्रोटीन के लिए प्राप्त करने के antisera सुझाव देते हैं. वैकल्पिक रूप से, अगर और एंटीबॉडी उपलब्ध है और नहीं है morpholino ब्याह या पूर्व mRNA में दाता साइट स्वीकर्ता या तो निर्देशित है, यह mRNA की कुशल splicing रोकेंगे. इस मामले में, यह संभव है का उपयोग करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर morphant शाही सेना में flanking दृश्यों को बढ़ाना और सामान्य splic अवरुद्ध की दक्षता का निर्धारणआईएनजी पैटर्न. जब नाक से पृष्ठीय वेंट्रल अक्ष पर अस्थायी sectioned retinas कर रहे हैं, छायांकित नीले बक्से (चित्रा 6) रेटिना कि सबसे अक्सर ही electroporation घटना से क्षतिग्रस्त हो रहे हैं के क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं. छायांकित गुलाबी बॉक्स क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है कि रेटिना की कोशिकाओं में electroporation द्वारा morpholino परिचय के लिए लक्षित है. चित्रा 1. योजनाबद्ध कॉर्निया के उपकला परतों को हटाने का चित्रण है. बाईं पैनल आँख के प्रमुख संरचनात्मक सुविधाओं (एल) लेंस, शीशे (विटामिन), रेटिना (नि.), बाहरी कॉर्निया (OC), भीतरी कॉर्निया (आईसी), और corneal फलाव सहित दिखाता है ( सीएल). आंख के उन्मुखीकरण के पहले पैनल के निचले सही में दिखाया गया है और पूर्वकाल (ए), पीछे (पी) पृष्ठीय (डी) लेबल, और ventral (वि). लाल रंगाई बाहर निकाल दिया जाता है कि कॉर्निया को इंगित करता है. दूसरा पैन एल से पता चलता है कैसे संदंश corneal फलाव समझ और आँख भर एक कम कोण (तीसरा पैनल) में बाहरी कॉर्निया खींच करने के लिए उपयोग किया जाता है. सही पैनल से पता चलता है कि कैसे संदंश के एक दूसरे जोड़ी स्थिर आँख करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि कॉर्निया खींच है. चित्रा 2 morpholino की intravitreal इंजेक्शन में शामिल कदम के योजनाबद्ध. एक छोटा सा चीरा आंख जहां शिष्य परितारिका (बाएं पैनल) से मिलता है में बनाया है. जिसके परिणामस्वरूप अंतर सिर्फ एक 33 गेज सुई है, जो morpholino समाधान, डाला जा (मध्य पैनल) के साथ भरा है के लिए काफी बड़े होना चाहिए. धीरे धीरे शीशे (राइट पैनल) में समाधान का 0.5 μl इंजेक्षन. आप vitreal समाधान की एक छोटी राशि चीरा के बाहर आने के रूप में शीशे का आंशिक रूप से साथ morpholino (राइट पैनल) lissamine – टैग द्वारा प्रतिस्थापित है कल्पना करना चाहिए. ig3.jpg "/> चित्रा 3 सामान्य electroporation प्रक्रिया के योजनाबद्ध. anesthetized मछली, जो intravitreally morpholino इंजेक्शन के साथ किया गया था धीरे नम कागज तौलिया (बाएं पैनल) में लिपटे है. कागज तौलिया गहरे नाले को कवर करना चाहिए, लेकिन बाधा डालती (मध्य पैनल) नहीं आँख. धीरे से नीचे आँख की वेंट्रल भाग पर इलेक्ट्रोड सकारात्मक प्रेस, आँख की पृष्ठीय आधा गर्तिका के बाहर बारी बारी से करने के लिए अनुमति. आँख की पृष्ठीय आधे से नकारात्मक इलेक्ट्रोड लगभग 1 मिमी प्लेस और electroporation (राइट पैनल) शुरू करते हैं. चित्रा 4 Confocal intravitreally lissamine टैग (ए) morpholino, और एक रेटिना intravitreally इंजेक्शन और lissamine टैग morpholino (बी) के साथ electroporated इंजेक्शन के बिना electroporated रेटिना की तुलना छवि. lissamine लेबल सभी रेटिना परतों और प्रकार की कोशिकाओं में पाया जाता है. ROS, रॉड बाहरीONL, बाहरी परमाणु परत;, लीग, भीतर परमाणु परत, GCL, नाड़ीग्रन्थि सेल परत क्षेत्रों. चित्रा 5 Confocal एक नियंत्रण (बाएं पैनल) morpholino और retinas के साथ एक विरोधी PCNA morpholino (सही पैनल) पूर्व प्रकाश प्रेरित फोटोरिसेप्टर कोशिका मृत्यु electroporated साथ electroporated retinas में PCNA immunolocalization तुलना छवियों . डार्क अनुकूलित वयस्क सूरजमुखी मनुष्य zebrafish morpholino की electroporation के बाद निरंतर तीव्र प्रकाश में 1, 2, या 3 दिन के लिए रखा गया था. नियंत्रण morpholino प्रकाश क्षतिग्रस्त retinas में बढ़ती PCNA अभिव्यक्ति को दबाने में असफल रहा. विरोधी PCNA morpholino कुशलता निरंतर तीव्र प्रकाश क्षति के तीन दिनों के माध्यम से नीचे PCNA प्रोटीन अभिव्यक्ति दस्तक दी. चित्रा 6 (बाएं पैनल) योजनाबद्ध पी के लिए आंख की व्याख्या दिखाrocessing और cryosectioning, जो पृष्ठीय वेंट्रल अक्ष के साथ किया जाता है. गुलाबी छायांकित बॉक्स (राइट पैनल) प्रोटीन पछाड़ना की इस तकनीक का उपयोग सबसे बड़ी राशि के साथ रेटिना क्षेत्र से पता चलता है. नीले रंग छायांकित बक्से क्षेत्रों में है कि सबसे अक्सर electroporation घटना से क्षतिग्रस्त हो रहे हैं प्रतिनिधित्व करते हैं. आंख के उन्मुखीकरण के पूर्वकाल (एक), पीछे (पी) पृष्ठीय (डी) लेबल है, और ventral (वि).

Discussion

हाल ही में, दो माइक्रोएरे विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन है कि या तो क्षतिग्रस्त रेटिना प्रकाश या एक शल्य चिकित्सा – excised ^{रेटिना पैच 10,} 16 के उत्थान के दौरान हुई जांच की. दोनों अध्ययनों से कई जीनों से पता चला है कि अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण बदलाव का प्रदर्शन किया, या तो बढ़ाने या कम है, की संभावना है कि अलग सेल चक्र में मुलर glia के पुनः प्रवेश के जैसे कि रेटिना उत्थान के दौरान होने की घटनाओं, के लिए आवश्यक हैं है, के प्रसार के प्रवास जारी रखा क्षतिग्रस्त रेटिना परत है, और सही neuronal सेल प्रकार में neuronal progenitors भेदभाव neuronal progenitors. जबकि इन दो माइक्रोएरे डेटा सेट के एक प्रत्यक्ष तुलना उम्मीदवार जीन है कि इन सेलुलर घटनाओं में शामिल हो सकता है पता चलता है, अंत में इन जीनों और उनके इनकोडिंग प्रोटीन निर्धारित करने के लिए अगर वे neuronal उत्थान के लिए आवश्यक हैं परीक्षण किया जाना चाहिए. यहाँ, हम conditio के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण हानि के समारोह का वर्णनnally वयस्क zebrafish रेटिना में ब्याज की पछाड़ना प्रोटीन. इस तकनीक को दोनों बाह्य और intracellular प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संकेतन अणुओं, प्रतिलेखन कारकों और डीएनए प्रतिकृति ^17-19 के लिए आवश्यक प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रकार, इस पद्धति बहुत आणविक zebrafish में वयस्क रेटिना उत्थान अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारी समझ सहायता प्राप्त है.

हम कई electroporation पैरामीटर के पहले एक सफल प्रोटोकॉल हासिल की थी (दालों की वोल्टेज, दालों के बीच समय) का परीक्षण किया. Regenerating zebrafish दुम का पंख में morpholinos electroporating के पिछले एक रिपोर्ट एक कम वोल्टेज (15 वी) ²⁰ पर 10 दालों का इस्तेमाल किया. क्योंकि वयस्क zebrafish रेटिना एकाधिक सेल परतों द्वारा घिरा हुआ है और आसानी से चिमटी से नोचना इलेक्ट्रोड सुलभ नहीं है, गतिविधियों में इस्तेमाल मापदंडों कुशलतापूर्वक वयस्क रेटिना में morpholinos electroporating में असफल रहे थे. इसके विपरीत, एक उच्च वोल्टेज (100 वी) अक्सर Res केमछली को मौत में ulted. हाल ही में, 80 के 5 दालों वी नवजात माउस पिल्ला ²¹ रेटिना में प्लास्मिड डीएनए electroporate वर्णित किया गया था. हमने पाया कि 75 साल की है कि एक से थोड़ा कम तीव्र 2 दालों वी इलाज मछली की 100% के अस्तित्व के साथ वयस्क zebrafish रेटिना में morpholinos के सफल electroporation में हुई. इसके अतिरिक्त, हम पता चला है कि बाहरी (या बाह्य सबसे) कॉर्निया के घटक सबसे हटाने बहुत electroporation दक्षता में वृद्धि हुई. दालों की संख्या बढ़ाने से इस ऊतक को हटाने के लिए समाप्त करने की जरूरत है, लेकिन यह भी अधिक से अधिक ऊतकों को नुकसान का कारण हो सकता है. व्यापक नियंत्रण के अध्ययन दिखा दिया है कि इन मानकों को किसी भी महत्वपूर्ण रेटिना कोशिका मृत्यु का कारण नहीं किया है या ^{विशिष्ट} सेलुलर प्रतिक्रियाओं बदल फोटोरिसेप्टर 19 उत्थान के दौरान मनाया. लाभ के समारोह अध्ययन वर्तमान में संभव नहीं हैं vivo में इस तकनीक, हमारी असमर्थता के कारण का उपयोग करने के लिए लगातार सभी r में बड़े ribonucleic एसिड electroporateetinal कोशिकाओं. हालांकि, vivo में माउस और explants में zebrafish रेटिना रेटिना में plasmids electroporating की सफलता से पता चलता है, ^{यह अभी भी} zebrafish 21, 22 में एक संभावना है.

इस तकनीक की ताकत है electroporation कुशलता से अलग रेटिना सेल प्रकार के सभी में morpholino परिचय होता है. हालांकि, एक संभावित कमजोरी थी कि electroporation कुशलता केवल पृष्ठीय और केंद्रीय रेटिना क्षेत्रों में morpholino वितरित. सभी परतों के लिए अच्छा लक्ष्यीकरण में रेटिना परिणामों के वेंट्रल छमाही की ओर एक दूसरे electroporation घटना है, लेकिन नुकसान में अक्सर परिणाम. यह स्थानिक प्रतिबंध की संभावना इलेक्ट्रोड के आकार और प्लेसमेंट के लिए कारण था. कस्टम डिजाइन कप आकार इलेक्ट्रोड है कि आँख के आसपास रखा जा सकता है है का उपयोग इस कमजोरी को सुधार सकता है. Morpholino डिलीवरी की यह स्थानिक प्रतिबंध इस तकनीक का उपयोग सीमा है और एक परख सफलता का उपयोग precludesएर्ग विश्लेषण के रूप में ज है कि रेटिना के एक वैश्विक मूल्यांकन की आवश्यकता होगी. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि किसी भी morpholino के साथ प्रयोग के रूप में, यह सलाह दी जाती है के लिए अपने परिणामों की पुष्टि लक्ष्य mRNA के लिए एक दूसरे, गैर अतिव्यापी morpholino का उपयोग करना चाहिए. कुछ मामलों में, यह संभव है भी एक साथ दो अलग morpholinos पछाड़ना के लिए दो अलग अलग प्रोटीन की अभिव्यक्ति electroporate. हम नीचे दोनों Pax6a और Pax6b प्रोटीन की अभिव्यक्ति दस्तक, व्यक्तिगत और संयोजन में ¹⁸ के द्वारा इस का प्रदर्शन किया .

हालांकि हम हमारे प्रकाश नुकसान मॉडल के साथ इस तकनीक के उपयोग का प्रदर्शन किया है, ^यह संभावना अन्य नुकसान 2-8 मॉडल में उत्थान अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या undamaged रेटिना में प्रोटीन के समारोह की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया. उदाहरण के लिए, morpholinos की electroporation नाड़ीग्रन्थि या लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिकाओं में विशिष्ट या चैनलों संकेत पारगमन अणुओं की अभिव्यक्ति पछाड़ना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और फिर इन संकेतन के समारोह का अध्ययनरास्ते में दृश्य प्रसंस्करण. हालांकि, के रूप में morpholinos केवल नए प्रोटीन का अनुवाद को प्रभावित, एक के लिए प्रतीक्षा करने के लिए जब तक अंतर्जात प्रोटीन कारोबार होता है पहले एक परख प्रदर्शन किया जा सकता होगा. प्रोटीन की स्थिरता पर निर्भर करता है, ^कि घंटे से 18 दिनों के लिए रेंज कर सकते हैं.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator	Protech International	CUY21EDIT or CUY21SC	Both units work for this protocol
3-mm diameter paddle electrodes	Protech International	CUY 650-P3
Morpholino	GeneTools, LLC		Morpholino should be custom designed to your protein of interest
2-Phenoxyethanol	Sigma	77861-1L	Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia
Dumont #5 tweezers	World Precision Instruments	14095	Any #5 tweezers with work
Dumont #5B tweezers with angled tips	World Precision Instruments	500234	Used to enucleate eye following euthanasia
Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle	World Precision Instruments	Blade: 500314 Handle: 500317
Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle	Hamilton company	Syringe: 87930 Needle: 7762-06	Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle