En metode til betinget Knockdown et mål protein udtryk i den voksne zebrafisk nethinden er beskrevet, hvilket indebærer intravitrealt injektion antisense morpholinos og electroporating dem ind i nethinden. Den resulterende protein er slået ned i flere dage, hvilket giver mulighed for test af protein rolle i regenerere eller intakte nethinden.
Mange ødelæggende arvelige øjensygdomme resultere i gradvise og uigenkaldelige blindhed, fordi mennesker ikke kan regenerere døende eller syge nethinde neuroner. I modsætning hertil har den voksne zebrafisk nethinden den robuste evnen til spontant at regenerere alle neuronal klasse, der er tabt i en række forskellige beskadigelse af nethinden modeller, inklusive retinal punktere, kemiske ablation, koncentreret høj temperatur, og intense lysbehandling 1-8. Vores lab grundigt karakteriseret regenerering af fotoreceptorer følgende konstant intense lys behandling og indre retinale neuroner efter intravitreal ouabain injektion 2, 5, 9. I alle tilfælde, bosiddende Müller glia genindtræde på cellecyklus at producere neurale stamceller, som fortsætter med at formere sig og migrere til den rette retinale lag, hvor de differentiere sig til den mangelfulde neuroner.
Vi er kendetegnet fem forskellige stadier under regenerering af lys-DamaGed nethinden, som blev fremhævet af specifikke cellulære respons. Vi har identificeret flere differentielt udtrykte gener på hvert trin i retinal regenerering af mRNA microarray analyse 10. Mange af disse gener er også kritisk for okulær udvikling. For at teste, hvilken rolle hver kandidat gen / protein i løbet af nethindeløsning regenerering, vi havde brug for at udvikle en metode til betinget begrænse udtryk for en kandidat protein kun på tidspunkter i løbet af regenerering af den voksne nethinden.
Morpholino oligos er almindeligt anvendt til at studere tab af funktion af specifikke proteiner under udviklingen af zebrafisk, Xenopus, chick, mus, og tumorer i menneskelige implanteret 11-14. Disse ændrede oligos basepair med komplementære RNA-sekvens enten at spærre for splejsning eller oversættelse af målet RNA. Morpholinos er stabile i cellen og kan eliminere eller "Knockout" protein udtryk i tre til fem dage 12.
Hervi beskriver en metode til effektivt at Knockdown target protein udtryk i den voksne zebrafisk nethinden. Denne metode benytter Lissamin-tagget antisense morpholinos, der sprøjtes ind i glaslegeme af den voksne zebrafisk øjet. Brug elektrode pincet, er morpholino så electroporated i alle celletyper i ryg og centrale nethinden. Lissamin giver afgiften på de morpholino for elektroporation, og kan visualiseres at vurdere tilstedeværelsen af morpholino i retinal celler.
Betinget Knockdown i nethinden kan bruges til at undersøge, hvilken rolle specifikke proteiner på forskellige tidspunkter i løbet af regenerering. Derudover kan denne metode bruges til at studere betydningen af specifikke proteiner i ubeskadiget nethinden, i sådanne processer som visuel transduktion og visuel forarbejdning i anden ordens neuroner.
For nylig, to microarray analyser undersøgt genekspression ændringer, der skete i løbet af regenerering af enten lys-beskadigede nethinden eller en kirurgisk fjernet retinal patch 10, 16. Begge undersøgelser viste en lang række gener, der udstilles væsentlige ændringer i sit udtryk, enten stigende eller faldende, som sandsynligvis er nødvendige for forskellige hændelser, der forekommer under retinale regenerering, såsom genindførsel af Müller glia ind i cellecyklus, fortsatte spredning og migration af neuronale forfædre til de beskadigede retinal lag, og differentieringen af det neurale stamceller ind i den korrekte neuronale celle type. Mens en direkte sammenligning af disse to microarray datasæt afslører kandidatgener, der kan inddrages i disse cellulære begivenheder i sidste ende disse gener og deres kodede proteiner skal testes for at afgøre, om de er nødvendige for neuronale regenerering. Her beskriver vi en kraftig tab af funktion tilgang til conditiointernt Knockdown proteiner af interesse i den voksne zebrafisk nethinden. Denne teknik har været anvendt til at studere både ekstracellulære og intracellulære proteiner samt signalmolekyler, transkriptionsfaktorer og proteiner nødvendig for DNA-replikation 17-19. Således har denne metode i høj grad hjulpet vores forståelse af den molekylære mekanisme bag voksne retinale regenerering i zebrafisk.
Vi har testet flere elektroporation parametre (spænding, antallet af impulser, tid mellem pulser), før en succesfuld protokol blev opnået. En tidligere rapport fra electroporating morpholinos i regenererende zebrafisk halefinnen brugt 10 impulser ved lav spænding (15 V) 20. Fordi den voksne zebrafisk nethinden er omgivet af flere cellelag og er ikke let tilgængelig for pincet elektroder, de parametre, der anvendes i fin lykkedes ikke at sikre effektiv electroporating morpholinos i den voksne nethinden. Omvendt er en høj spænding (100 V) ofte resulted i døden til fiskene. For nylig, 5 pulser på 80 V blev beskrevet at electroporate plasmid DNA i den nyfødte mus hvalpen nethinden 21. Vi fandt, at en lidt mindre intens 2 pulser på 75 V resulterede i vellykket elektroporation af morpholinos ind i den voksne zebrafisk nethinden med overlevelse på 100% af de behandlede fisk. Derudover opdagede vi, at fjernelsen af den ydre mest (eller ekstern fleste) del af hornhinden i høj grad øget elektroporation effektivitet. At øge antallet af impulser kan fjerne behovet for fjernelse af dette væv, men kan også forårsage større vævsskader. Omfattende kontrol undersøgelser vist, at disse parametre ikke medfører væsentlige retinal celledød eller ændre den specifikke cellulære respons observeret i løbet af fotoreceptor regenerering 19. Gain-of-funktion undersøgelser er i øjeblikket ikke muligt at bruge denne teknik in vivo, på grund af vores manglende evne til konsekvent at electroporate store rebonukleinsyre syrer i alle retinal celler. Men den succes electroporating plasmider i mus nethinden in vivo og zebrafisk nethinden i eksplanteret antyder er det stadig en mulighed i zebrafisk 21, 22.
En af styrkerne ved denne teknik er elektroporation tilsyneladende effektivt indføre morpholino i alle de forskellige retinal celletyper. Men en potentiel svaghed var, at elektroporation effektivt leveret morpholino ind kun ryg og centrale retinal regioner. En anden elektroporation begivenhed mod ventrale halvdel af nethinden resultater i god målretning til alle lag, men ofte resulterer i skader. Denne rumlige begrænsning sandsynligvis skyldtes den form og placering af elektroder. Brugen af specialdesignede kop formede elektroder, der kunne placeres omkring øjet kan forbedre denne svaghed. Denne rumlige begrænsning af morpholino levering begrænser brugen af denne teknik, og udelukker anvendelsen af en analyse sucH som ERG analyse, der vil kræve en samlet vurdering af nethinden. Det skal bemærkes, at som med alle morpholino eksperiment, er det tilrådeligt at bekræfte dine resultater ved hjælp af en anden, ikke-overlappende morpholino til målet mRNA. I nogle tilfælde er det også muligt at electroporate to forskellige morpholinos samtidigt for at Knockdown udtryk for to forskellige proteiner. Vi har demonstreret dette ved at banke ned udtryk for både Pax6a og Pax6b proteiner, enkeltvis og i kombination 18.
Selvom vi demonstreret brugen af denne teknik med vores lys skader model, kunne det sandsynligvis blive brugt til at studere regenerering i andre skader modeller 2-8 eller bruges til at undersøge funktionen af proteiner i ubeskadiget nethinden. For eksempel kunne elektroporation af morpholinos bruges til at Knockdown udtryk for bestemte kanaler eller signaltransduktion molekyler i ganglion eller amacrine celler og derefter studere funktionen af disse signaleringveje i visuel bearbejdning. Men da morpholinos kun påvirke oversættelse af nye protein, ville man være nødt til at vente, indtil endogene protein omsætningen sker, før en analyse kunne udføres. Afhængigt af stabiliteten af det protein, kan der spænder fra timer til dage 18.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Freimann Life Science Center og Center for zebrafisk Forskning personale for deres pleje og vedligeholdelse af zebrafisk.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 14095 | Any #5 tweezers with work |
Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments | Blade: 500314 Handle: 500317 |
|
Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton company | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 |
Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |