Vi beskriver en metode for å betinget knockdown uttrykk for et mål protein i løpet av voksen sebrafisk fin tilvekst. Denne teknikken innebærer mikro-injisering og electroporating antisens oligonukleotid morpholinos inn fin vev, noe som gjør testing av protein rolle i ulike stadier av fin foryngelse, inkludert sårtilheling, blastema formasjon, og regenerativ utvekst.
Visse arter av urodeles og teleost fisk kan regenerere sine vev. Sebrafisk har blitt en mye brukt modell for å studere spontan regenerering av voksne vev, for eksempel hjerte 1, netthinnen 2, ryggmarg 3, synsnerven 4, sensoriske hårceller 5, og 6 svømmeføtter.
Sebrafisk FIN er en relativt enkel vedheng som er lett manipuleres til å studere flere stadier i epimorphic foryngelse. Klassisk, var fin gjenfødelse preget av tre distinkte stadier: sårtilheling, blastema formasjon, og fin utvekst. Etter amputere en del av fin, proliferates rundt epitel og migrerer over såret. Ved 33 ° C, skjer denne prosessen innen seks timer etter amputasjon (hPa, Figur 1B) 6,7. Deretter underliggende celler fra forskjellige linjene (ex. bein, blod, gliaceller, fibroblast) re-gå inn i cellen syklus å danne en proliferativ blastema, while overliggende epidermis fortsetter å spre seg (figur 1D) 8. Utvekst oppstår som celler proksimalt for blastema re-differensiere i sine respektive linjer for å danne nytt vev (figur 1E) 8. Avhengig av nivå amputasjonen, er full regenerering ferdig i en uke til en måned.
Uttrykket av et stort antall gener familier, inkludert Wnt, Hox, FGF, MSX, retinsyre, ssh, hakk, bmp, og activin-beta A gener, er oppregulert under bestemte stadier av FIN regenerering 9-16. Imidlertid har rollene til disse genene og deres kodede proteiner under regenerering vært vanskelig å vurdere, med mindre en spesifikk hemmer for proteinet finnes 13, en temperatur-sensitiv mutant eksisterer eller en transgen dyr (enten overekspresjon villtype protein eller en dominerende -negative protein) ble generert 7,12. Vi utvikledeped en omvendt genetisk teknikk for å raskt og enkelt teste funksjonen av enhver genet under FIN gjenfødelse.
Morpholino oligonukleotider er mye brukt til å studere tap av spesifikke proteiner i løpet av sebrafisk, Xenopus, kylling, og mus utvikling 17-19. Morpholinos basepair med en komplementær RNA sekvensen til enten blokk pre-mRNA spleising eller mRNA oversettelse. Vi beskriver en metode for å effektivt introdusere fluorescein-merket antisens morpholinos inn regenererende sebrafisk svømmeføtter til knockdown uttrykk av målet protein. Den Morpholino er mikro-injiseres i hvert blastema av regenererende sebrafisk halefinnen og electroporated i de omkringliggende cellene. Fluorescein gir denne prisen til electroporate den Morpholino og å visualisere Morpholino i fin vev.
Denne protokollen tillater betinget protein knockdown å undersøke rollen av spesifikke proteiner under regenerativ fin utvekst. I Discussion, beskriver vi hvordan denne tilnærmingen kan tilpasses å studere rollen av spesifikke proteiner i løpet av sårtilheling eller blastema formasjon, samt en potensiell markør for celle migrasjon under blastema formasjon.
Her beskriver vi et kraftig tap-av-funksjon tilnærming til betinget knockdown proteiner av interesse under fin tilvekst i voksen sebrafisk. Denne teknikken har blitt brukt til å studere gap koblingsbokser gener, signaliserer reseptorer, transkripsjonsfaktorer, og microRNAs under regenerativ fin utvekst 16, 20-22.
Vi forventer at denne teknikken kan også brukes til å studere gener som kreves for sårheling og blastema formasjon ved å tilpasse teknikken. For eksempel, injisert vi og electroporated en kontroll Morpholino i mellomrommet mellom de beinete fin stråler på dorsal halvparten av fin før amputasjon (figur 7). Vi så amputert finnen umiddelbart distalt for injeksjon flyet. 24 hpa, observerte vi at Morpholino målrettede celler hadde migrert distalt for å danne både såret epitel og blastema (Figur 8), som indikerer at celler i løpet av disse tidlige stadiene av regenerering kan også Targeted.
Teknikken har noen få bemerkelsesverdige begrensninger. For eksempel ikke fluorescens fra fluorescein tag ikke vedvare etter fiksering og behandling for immunhistokjemi, som gjør det umulig å korrelere en bestemt cellulær fenotype (dvs. celleproliferasjon) med mengden Morpholino tilstede i en celle. I tillegg har vi vært i stand til å konsekvent oppnå electroporation av plasmider inn i gjenfødelse halefinnen, selv om en tidligere gruppe gjorde rapportere vellykket electroporation av DNA inn i fin vev 23. Endelig har vi registrert at det Morpholino er bare effektivt for ~~~HEAD=NNS 48 timer etter 21 electroporation, som forbyr bruk av denne teknikken i sin nåværende form for testing gener involvert i differensieringen av nye celletyper. Ytterligere testing og modifisering av prosedyren kan overvinne disse dagens begrensninger.
I tillegg er det mulig at denne teknikken kan brukeså teste proteiner involvert i celle migrasjon fra det underliggende vevet til blastema. For eksempel, injisert vi og electroporated en kontroll Morpholino inn begge sider av FIN (som beskrevet i figur 7) før amputasjon. Vi så amputert dorsal halvdel av fin umiddelbart distalt for injeksjon flyet og vi amputert den ventrale fin mye mer distalt. På 24 hpa, hadde Morpholino-positive celler på dorsal side migrert fra injeksjonsstedet til overliggende såret epitel og blastema. Men, det var ikke tilfelle på den ventrale siden (figur 9). Dette støtter ideen om at bare de cellene som ligger til grunn amputasjon flyet delta i regenerativ respons. Disse dataene tyder også på at proteiner antatt å være nødvendig for celle migrasjon kan testes ved hjelp av denne teknikken.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Freimann Life Science Center og Center for sebrafisk forskning personalet for deres pleie og vedlikehold av sebrafisk.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Micro-injection pump | World Precision Instruments | PV830 Pneumatic PicoPump | Many different microinjection systems could be used |
Micro-manipulator | World Precision Instruments | MMJR | Right-handed (MMJL for left-handed) |
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
Needle holder | World Precision Instruments | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
Needle puller | Sutter | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |