Wir beschreiben ein Verfahren zur bedingten Knockdown die Expression eines Zielproteins im Erwachsenenalter Zebrafisch Flossenregeneration. Diese Technik beinhaltet Mikrospritzvorrichtung und Elektroporation Antisense-Oligonukleotid in Morpholinos Flossengewebes das Testen des Proteins Rolle in verschiedenen Stadien der Flossenregeneration, einschließlich Wundheilung, Blastembildung und regenerative Auswachsen ermöglicht.
Bestimmte Arten von Urodelen und Knochenfische regenerieren kann ihren Geweben. Zebrafisch haben zu einem weit verbreiteten Modell, um die spontane Regeneration der adulten Geweben wie Herz 1, Retina 2, Rückenmark 3, Sehnerv 4, sensorischer Haarzellen 5 und Rippen 6 zu untersuchen.
Der Zebrafisch Rippe ist eine relativ einfache Ansatz, die leicht manipuliert wird, um mehrere Stufen in epimorphe Regeneration zu studieren. Wundheilung, Blastembildung und Flosse Auswuchs: Klassischerweise wurde fin Regeneration durch drei Phasen gekennzeichnet. Nach Amputation Teil der Flosse, wuchert das umgebende Epithel und wandert über die Wunde. Bei 33 ° C, tritt dieser Prozess innerhalb von sechs Stunden nach der Amputation (hPa, 1B) 6,7. Als nächstes zugrunde liegenden Zellen aus verschiedenen Linien (z. B. Knochen, Blut, Gliazellen, Fibroblasten) Wiedereinstieg in den Zellzyklus zu einem proliferativen Blastem, während die darüber liegende Epidermis weiter zu vermehren (1D) 8. Auswuchs tritt als Zellen proximal zu dem Blastem in ihre jeweiligen Linien neu zu differenzieren, um neues Gewebe (1E) 8 zu bilden. Abhängig von der Höhe der Amputation, wird die volle Regeneration in einer Woche bis zu einem Monat abgeschlossen.
Die Expression einer großen Anzahl von Gen-Familien, darunter wnt, Hox-, FGF, MSX, Retinsäure, sch, Kerbe, BMP und Aktivin A-beta-Gene, ist hochreguliert während bestimmter Phasen der Regeneration fin 16.09. Allerdings haben die Rolle dieser Gene und ihren codierten Proteinen während der Regeneration schwierig zu beurteilen, wenn ein spezifischer Inhibitor für das Protein existiert 13, eine temperaturempfindliche Mutante besteht, oder ein transgenes Tier (entweder Überexpression des Wildtyp-Proteins oder eine dominant -negatives Protein) wurde 7,12 erzeugt. Wir entwiped ein Reverse genetische Technik, um schnell und einfach testen Sie die Funktion eines Gens während der Finne Regeneration.
Morpholino-Oligonukleotide werden häufig verwendet, um den Verlust von spezifischen Proteinen während der Zebrafisch, Xenopus, Huhn und Maus Entwicklung 17-19 studieren. Morpholinos Basenpaar mit einem komplementären RNA-Sequenz entweder Block-prä-mRNA-Splicing oder mRNA-Translation. Wir beschreiben ein Verfahren zur effizienten Einführung Fluorescein-markierten Antisense-Morpholino in Regenerieren Zebrafisch Rippen den Zuschlag Expression des Zielproteins. Der Morpholino wird in jede Blastem der regenerierenden Zebrafisch Schwanzflosse Mikro-Injektion und Elektroporation in die umliegenden Zellen. Fluorescein liefert die Ladung zu den Morpholino elektroporieren und die Morpholino im Flossengewebes visualisieren.
Dieses Protokoll erlaubt bedingten Protein Knockdown, um die Rolle von spezifischen Proteinen während der regenerativen fin Auswuchs zu untersuchen. In der Discussion beschreiben wir, wie dieser Ansatz angepasst werden, um die Rolle von spezifischen Proteinen während der Wundheilung oder Blastembildung, sowie ein potentieller Marker für Zellmigration in Blastembildung zu untersuchen.
Hier beschreiben wir eine leistungsstarke loss-of-function-Ansatz bedingt Knockdown Proteine von Interesse während der Finne Regeneration in adulten Zebrafisch. Diese Technik wurde verwendet, um Gene zu studieren Gap Junction-, Signal-Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, und microRNAs während regenerative fin Auswuchs 16, 20-22.
Wir erwarten, dass diese Technik auch verwendet werden, um Gene für die Wundheilung und Blastembildung durch Anpassung der Technik erforderlich zu untersuchen. Zum Beispiel, injizierten wir elektroporiert und eine Kontrolle Morpholino in den Raum zwischen den knöchernen Flossenstrahlen auf der dorsalen Hälfte der Finne vor der Amputation (Abbildung 7). Wir haben dann die Flosse unmittelbar distal der Injektion Flugzeug amputiert. 24 hPa, beobachteten wir, dass die Morpholino-Zielzellen hatte distal, um sowohl die Wunde Epithel und Blastem (Abbildung 8) bilden migriert, was darauf hinweist, dass die Zellen während dieser frühen Phasen der Regeneration kann auch TargETED.
Die Technik hat ein paar bemerkenswerte Einschränkungen. Zum Beispiel ist die Fluoreszenz von Fluorescein-nicht beibehalten folgenden Fixierung und Verarbeitung für die Immunhistochemie, die es unmöglich, eine bestimmte zelluläre Phänotyp (dh Zell-Proliferation) mit der Menge an Morpholino in einer Zelle korreliert ist. Darüber hinaus ist es nicht gelungen, dauerhaft die Elektroporation von Plasmiden in der Regeneration Heckflosse, obwohl eine vorherige Gruppe auch taten die erfolgreiche Elektroporation von DNA in Flossengewebes 23. Schließlich haben wir festgestellt, dass die Morpholino nur wirksam für ~ 48 Stunden nach der Elektroporation 21, die mit dieser Technik in seiner jetzigen Form für die Prüfung Gene bei der Differenzierung von neuen Zelltypen beteiligt ist untersagt. Zusätzliche Tests und Modifikation des Verfahrens, kann überwunden werden diese aktuellen Einschränkungen.
Darüber hinaus ist es möglich, dass diese Technik verwendet werden könntenan Proteine der Zellwanderung vom darunter liegenden Gewebe zum Blastem beteiligt zu testen. Zum Beispiel, injizierten wir und Elektroporation ein Steuersignal Morpholino in beide Seiten der Rippe (wie in 7 beschrieben) vor der Amputation. Wir haben dann die dorsale Hälfte der Finne unmittelbar distal der Injektion Flugzeug amputiert und wir amputiert die Bauchflosse viel mehr distal. Bei 24 hPa, hatten die Morpholino-positive Zellen auf der Rückenseite von der Injektionsstelle, um die darüber liegende Epithel und Wunde Blastem migriert. Das war jedoch nicht der Fall ist auf der Bauchseite (Abbildung 9). Dies stützt die Idee, dass nur die Zellen, die die Amputation Ebene zugrunde liegen, in der regenerative Reaktion teilnehmen. Diese Daten legen nahe, dass auch Proteine für die Hypothese aufgestellt, um die Zellwanderung erforderlich getestet werden konnte mit Hilfe dieser Technik werden.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten die Freimann Life Science Center und Center for Zebrafisch-Forschung Mitarbeiter danken für ihre Pflege und Wartung des Zebrafisch.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Micro-injection pump | World Precision Instruments | PV830 Pneumatic PicoPump | Many different microinjection systems could be used |
Micro-manipulator | World Precision Instruments | MMJR | Right-handed (MMJL for left-handed) |
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
Needle holder | World Precision Instruments | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
Needle puller | Sutter | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |