Vi beskriver en fremgangsmåde til konditionelt knockdown ekspressionen af et målprotein i voksne zebrafisk fin regenerering. Denne teknik involverer mikro-injektion, og elektroporering antisense oligonucleotid morpholinos i fin væv, som tillader afprøvning af proteinets rolle i forskellige stadier af fin regenerering, herunder sårheling, blastema dannelse og regenerative udvækst.
Visse arter af urodeles og benfisk kan regenerere deres væv. Zebrafisk er blevet en meget anvendt model til at studere spontan regenerering af voksent væv, såsom hjerte 1, retina 2, rygmarv 3, synsnerven 4, sansehårceller 5 og finner 6.
Zebrafisken finne er en forholdsvis enkel vedhæng, der er let manipuleres til at studere forskellige stadier i epimorphic regenerering. Klassisk, var fin regenerering karakteriseret ved tre forskellige stadier: sårheling, blastema dannelse, og fin udvækst. Efter amputation del af finnen, prolifererer den omgivende epitel og migrerer over såret. Ved 33 ° C, hvilket proces sker inden for seks timer efter amputation (HPA, figur 1B) 6,7. Dernæst underliggende celler fra forskellige slægter (ex. knogle, blod, glia, fibroblast) igen ind i cellecyklus at danne en proliferativ blastema, wganske vist i den overliggende epidermis fortsætter med at proliferere (figur 1D) 8. Udvækst forekommer som celler proksimalt for blastema igen differentiere ind i deres respektive linier til dannelse af nyt væv (fig. 1E) 8. Afhængig af amputation, er fuld regenerering afsluttet i en uge til en måned.
Ekspressionen af et stort antal genfamilier, herunder Wnt, HOX, FGF, MSX, retinsyre, Shh, notch, BMP og activin-beta A gener, er opreguleret i specifikke faser af fin regenerering 9-16. Imidlertid har de roller for disse gener og deres kodede proteiner under regenerering været vanskeligt at vurdere, hvis en specifik inhibitor for proteinet eksisterer 13, en temperaturfølsom mutant eksisterer eller et transgent dyr (enten overudtrykker vildtype-protein eller et dominerende -negative protein) blev genereret 7,12. Vi udvikPED en omvendt genetisk teknik til hurtigt og let teste funktionen af ethvert gen under fin regenerering.
Morpholino oligonukleotider er almindeligt anvendt til undersøgelse tab af specifikke proteiner under zebrafisk, Xenopus, kylling, og mus udvikling 17-19. Morpholinos basepar med en komplementær RNA-sekvens til hver blok præ-mRNA-splejsning eller mRNA translation. Vi beskriver en fremgangsmåde til effektivt at indføre fluorescein-mærket antisense morpholinos i regenererende zebrafisk finner knockdown ekspression af målproteinet. Den morpholino er mikroinjiceres i hver blastema af regenererende zebrafisk halefinnen og elektroporeret ind i de omgivende celler. Fluorescein giver afgift til elektroporere morpholino og at visualisere morfolino i fin vævet.
Denne protokol tillader betinget protein Knockdown at undersøge betydningen af specifikke proteiner under regenerativ fin udgroning. I Discussion, vi beskriver, hvordan denne fremgangsmåde kan tilpasses til at studere rollen af specifikke proteiner under sårheling eller blastema dannelse, såvel som en potentiel markør for cellemigrering under blastema dannelse.
Her beskriver vi en kraftig tab af funktion tilgang til betinget Knockdown proteiner af interesse i fin regenerering hos voksne zebrafisk. Denne teknik er blevet anvendt til at undersøge gap junction gener, signalering receptorer, transkriptionsfaktorer og microRNA'er under regenerativ fin udvækst 16, 20-22.
Vi forventer, at denne teknik også kan anvendes til at studere gener, der kræves til sårheling og blastema dannelse ved at tilpasse teknikken. For eksempel injiceres vi og elektroporeret en kontrol morpholino i rummet mellem benet finne stråler på den dorsale halvdel af finnen før amputation (figur 7). Vi så amputerede finnen umiddelbart distalt for injektionen flyet. 24 hPa, observerede vi, at morpholino-målrettede celler havde migreret distalt til dannelse både såret epitel og blastema (figur 8), hvilket indikerer, at cellerne i disse tidlige stadier af regeneration kan også Targeted.
Teknikken har et par bemærkelsesværdige begrænsninger. For eksempel giver fluorescens fra fluorescein mærket ikke fortsætter efter fiksering og bearbejdning for immunohistokemi, hvilket gør det umuligt at korrelere et bestemt cellulært fænotype (dvs. celleproliferation) med mængden af morpholino stede i en celle. Derudover har vi været i stand til konsekvent at opnå den elektroporering af plasmider ind regenerering halefinnen, selv om en tidligere gruppe har rapporteret en vellykket elektroporation af DNA i fin væv 23. Endelig har vi bemærket, at morfolino er kun effektiv i ~ 48 timer efter elektroporation 21, der forbyder at bruge denne teknik i sin nuværende form til at teste gener involveret i differentieringen af nye celletyper. Yderligere test og ændring af proceduren kan overvinde disse nuværende begrænsninger.
Derudover er det muligt, at denne teknik kan anvendesat teste proteiner involveret i cellemigrering fra det underliggende væv til blastema. For eksempel injiceres vi og elektroporeret en kontrol morpholino i begge sider af finnen (som beskrevet i figur 7) forud for amputation. Vi så amputerede den dorsale halvdel af finnen umiddelbart distalt for injektionen flyet, og vi amputeret den ventrale finnen meget mere distalt. Ved 24 hPa havde morpholino-positive celler på den dorsale side migrerede fra injektionsstedet til det overliggende såret epitel og blastema. Men det var ikke tilfældet på den ventrale side (figur 9). Dette understøtter ideen om, at kun de celler, der ligger til grund for amputation flyet deltage i regenerative respons. Disse data antyder også, at proteiner hypotese at være nødvendig for cellemigrering kan testes ved hjælp af denne teknik.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Freimann Life Science Center og Center for Zebrafisk Forskning personale til deres pleje og vedligeholdelse af zebrafisk.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Micro-injection pump | World Precision Instruments | PV830 Pneumatic PicoPump | Many different microinjection systems could be used |
Micro-manipulator | World Precision Instruments | MMJR | Right-handed (MMJL for left-handed) |
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
Needle holder | World Precision Instruments | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
Needle puller | Sutter | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |