We beschrijven een methode om de expressie van een doeleiwit voorwaardelijk knockdown op volwassen zebravissen fin regeneratie. Deze techniek micro-injectie en electroporating antisense oligonucleotide morpholinos in fin weefsel, zodat het testen van het eiwit rol in verschillende stadia van fin regeneratie onder wondgenezing blastema vorming en regeneratieve uitgroei.
Bepaalde soorten van urodeles en beenvissen kan regenereren hun weefsels. De zebravis zijn uitgegroeid tot een veel gebruikt model om de spontane regeneratie van volwassen weefsels, zoals het hart 1, 2 netvlies, het ruggenmerg 3, oogzenuw 4, sensorische haarcellen 5, 6 en vinnen te bestuderen.
De zebravis vin is een relatief eenvoudig aanhangsel dat gemakkelijk kan worden gemanipuleerd om meerdere stadia te bestuderen in epimorphic regeneratie. Klassiek, werd fin regeneratie gekenmerkt door drie verschillende fasen: wondgenezing, blastema vorming, en gewone uitgroei. Na het amputeren van een deel van de vin, de omliggende epitheel woekert en migreert over de wond. Bij 33 ° C, dit proces plaatsvindt binnen de zes uur na de amputatie (hpa, figuur 1B) 6,7. Vervolgens onderliggende cellen van verschillende geslachten (bv. botten, bloed, glia, fibroblast) opnieuw in te voeren de celcyclus van een proliferatieve blastema, w vormenhile de bovenliggende opperhuid blijft woekeren (figuur 1D) 8. Uitgroei optreedt als cellen proximaal blastema opnieuw differentiëren in hun lijnen nieuwe weefsel (Figuur 1e) 8 vormen. Afhankelijk van het niveau van de amputatie, wordt volledige regeneratie voltooid in een week tot een maand.
De expressie van een groot aantal van gen-families, met inbegrip van Wnt, Hox, FGF, MSX, retinoïnezuur, shh, notch, bmp, en activine-bèta A genen, is up-gereguleerd tijdens bepaalde fases van fin regeneratie 9-16. Echter, de rol van deze genen en hun gecodeerde eiwitten tijdens regeneratie moeilijk te evalueren, tenzij een specifieke inhibitor voor het eiwit bestaat 13 een temperatuur-gevoelige mutant bestaat of een transgeen dier (hetzij tot overexpressie het wild-type eiwit of een dominante -negatieve eiwit) werd gegenereerd 7,12. We ontwikped omgekeerde genetische techniek om de functie van elk gen snel en gemakkelijk te testen gedurende fin regeneratie.
Morfolino oligonucleotiden worden veel gebruikt om het verlies van specifieke eiwitten te bestuderen tijdens de zebravis, Xenopus, kuiken, en de ontwikkeling van de muis 17-19. Morpholinos basenparen met een complementair RNA sequentie, regel pre-mRNA splicing of mRNA translation. Wij beschrijven een methode om efficiënt fluoresceïne-gelabeld antisense morpholinos voeren in regenereren zebravis vinnen knockdown expressie van het doelwiteiwit. De morfolino is micro-geïnjecteerd in elk blastema van de regeneratie van zebravis staartvin en geëlektroporeerd in de omringende cellen. Fluoresceïne biedt de invoer van de morfolino electroporate en de morfolino visualiseren in de vin weefsel.
Dit protocol maakt voorwaardelijke proteïne knockdown om de rol van specifieke eiwitten te onderzoeken tijdens de regeneratieve fin uitgroei. In de Discussion wordt beschreven hoe deze aanpak kan worden aangepast aan het gebruik van specifieke bestuderen tijdens wondgenezing of blastema vorming en een potentiële marker celmigratie tijdens blastema vorming.
We beschrijven hier een krachtige verlies-van-functie benadering van de voorwaardelijk knockdown eiwitten van belang tijdens het fin de regeneratie bij volwassen zebravissen. Deze techniek is gebruikt om gap junction genen te bestuderen, signalering receptoren, transcriptiefactoren, en microRNA's tijdens de regeneratieve fin uitgroei 16, 20-22.
We verwachten dat deze techniek ook kan worden gebruikt om genen die vereist zijn voor wondgenezing en blastema vorming door aanpassing van de techniek te bestuderen. Zo hebben wij geïnjecteerd en geëlektroporeerd een controle morfolino in de ruimte tussen het bot vinnen op de rug helft van de vin voor amputatie (Figuur 7). We hebben toen geamputeerd de vin direct distaal van de injectie vlak. 24 hPa, zagen we dat de morfolino gerichte cellen distaal was gemigreerd naar zowel de wond epitheel en blastema (figuur 8) te vormen, wat aangeeft dat cellen tijdens deze vroege stadia van de regeneratie kan ook worden Targeted.
De techniek heeft een paar opvallende beperkingen. Bijvoorbeeld, de fluorescentie van de fluorescentie label niet bestaan volgende fixatie en verwerking voor immunohistochemie, waardoor het onmogelijk om een bepaalde cellulaire fenotype (bijv. celproliferatie) correleren met de hoeveelheid morfolino in een cel. Daarnaast hebben wij in staat om de elektroporatie van plasmiden consistent bereiken in de regeneratiezone staartvin, hoewel vorige groep heeft rapporteren succesvolle elektroporatie van DNA in fin weefsel 23. Ten slotte hebben wij opgemerkt dat de morfolino is alleen effectief voor ~ 48 uur na de elektroporatie 21, die verbiedt het gebruik van deze techniek in zijn huidige vorm voor het testen van genen die betrokken zijn bij de differentiatie van nieuwe celtypen. Aanvullend onderzoek en wijziging van de procedure kan het overwinnen van deze huidige beperkingen.
Bovendien is het mogelijk dat deze techniek kan worden gebruikteiwitten die zijn betrokken bij celmigratie van het onderliggende weefsel de blastema testen. Zo hebben wij geïnjecteerd en geëlektroporeerd een controle morfolino in beide kanten van de vin (zoals beschreven in figuur 7) voor amputatie. We hebben toen geamputeerd de dorsale helft van de vin direct distaal van de injectie vliegtuig en we geamputeerd de ventrale vinnen veel meer distaal. Na 24 hPa, had de morfolino-positieve cellen aan de dorsale zijde gemigreerd van de plaats van injectie naar de bovenliggende wond epitheel en blastema. Maar dat was niet het geval op de ventrale zijde (Figuur 9). Dit ondersteunt het idee dat alleen de cellen die de amputatie vliegtuig ten grondslag liggen aan deel te nemen aan de regeneratieve respons. Deze gegevens suggereren ook dat eiwitten hypothese te worden die nodig zijn voor celmigratie kan worden getest met behulp van deze techniek.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag de Freimann Life Science Center en Center bedanken voor Zebravissen Onderzoek personeel voor hun verzorging en het onderhoud van de zebravis.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Micro-injection pump | World Precision Instruments | PV830 Pneumatic PicoPump | Many different microinjection systems could be used |
Micro-manipulator | World Precision Instruments | MMJR | Right-handed (MMJL for left-handed) |
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
Needle holder | World Precision Instruments | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
Needle puller | Sutter | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |