Vi beskriver en metod för att villkorligt knockdown uttrycket av ett målprotein vid vuxen zebrafisk fena regenerering. Denna teknik innebär att mikro-injektion och elektroporera morpholinos Antisensoligonukleotid i fin vävnad, vilket gör att testa proteinets roll i olika stadier av fin förnyelse, inklusive sårläkning, blastema bildning, och regenerativ utväxt.
Vissa arter av urodeles och teleost fisk kan regenerera sina vävnader. Zebrafisk har blivit en allmänt använd modell för att studera den spontana regenerering av vuxna vävnader, såsom hjärta 1, näthinnan 2, ryggmärg 3, synnerven 4, sensoriska hörselceller 5, och fenor 6.
Zebrafisk fena är en relativt enkel bihang som lätt manipuleras för att studera flera steg i epimorphic regenerering. Klassiskt, var fin förnyelse präglas av tre olika steg: sårläkning, blastema formation och fin utväxt. Efter amputering del av fenan, prolifererar omgivande epitel-och migrerar över såret. Vid 33 ° C, sker denna process i sex timmar efter amputation (HPA, figur 1B) 6,7. Därefter underliggande celler från olika linjer (ex. ben, blod, glia, fibroblast) tillbaka in i cellcykeln för att bilda en proliferativ blastema, wedan den överliggande epidermis fortsätter att föröka sig (figur 1D) 8. Utväxt inträffar som celler proximalt till blastema åter differentiera till sina respektive linjerna för att bilda ny vävnad (fig 1E) 8. Beroende på nivån på amputation, är fullt regenerering klar i en vecka till en månad.
Uttrycket av ett stort antal genfamiljer, inklusive Wnt, HOX, FGF, MSX, retinoinsyra, Shh, Notch, bmp, och aktivin-beta A gener, är upp-regleras under olika etapperna i fin förnyelse 9-16. Emellertid har de roller för dessa gener och deras kodade proteiner under regenerering varit svårt att bedöma, om inte en specifik inhibitor för proteinet existerar 13, en temperaturkänslig mutant föreligger eller ett transgent djur (antingen som överuttrycker vildtyp-protein eller en dominerande -negativ protein) genererades 7,12. Vi utvecklatPED en omvänd genetisk teknik för att snabbt och enkelt testa funktionen av varje gen under fin regeneration.
Morfolino oligonukleotider används ofta för att studera förlust av specifika proteiner under zebrafisk, Xenopus, kyckling och mus utveckling 17-19. Morpholinos baspar med en komplementär RNA-sekvens till antingen blocket pre-mRNA-splitsning eller mRNA-translation. Vi beskriver ett förfarande för att effektivt införa fluorescein-märkt antisens morpholinos i regenererande zebrafisk fenor till knockdown uttryck av målproteinet. Den morfolino är mikroinjicerades in i varje blastema av den regenererande zebrafisk stjärtfenan och elektroporerades in i de omgivande cellerna. Fluorescein ger laddning till elektroporera att morfolino och visualisera morfolino i fin vävnad.
Detta protokoll möjliggör villkorligt protein knockdown att undersöka vilken roll specifika proteiner under regenerativ fin utväxt. I Discussion, beskriver vi hur denna metod kan anpassas för att studera betydelsen av specifika proteiner under sårläkning eller blastema bildning, samt en potentiell markör för cellmigration under blastema bildning.
Här beskriver vi en kraftfull förlust av funktionen förhållningssätt till villkorligt knockdown proteiner av intresse under fin regeneration i vuxen zebrafisk. Denna teknik har använts för att studera gener gap junction, signalering receptorer, transkriptionsfaktorer och mikroRNA under regenerativ fena utväxt 16, 20-22.
Vi förväntar oss att denna teknik också kan användas för att studera gener som krävs för sårläkning och blastema bildning genom att anpassa tekniken. Till exempel, injicerade vi och elektroporerades en kontroll morfolino i utrymmet mellan de beniga fenan strålar på den dorsala delen av fenan före amputation (Figur 7). Vi amputerade sedan fenan omedelbart distalt om injektionen planet. 24 hPa, observerade vi att morfolino riktade celler hade migrerat distalt att bilda både såret epitelet och blastema (Figur 8), vilket indikerar att celler under dessa tidiga stadier av förnyelse kan också Targeted.
Tekniken har några anmärkningsvärda begränsningar. Till exempel, kvarstår fluorescens från fluorescein taggen inte efter fixering och bearbetning för immunohistokemi, vilket gör det omöjligt att korrelera en särskild cellulär fenotyp (dvs cell-proliferation) med mängden av morfolino närvarande i en cell. Dessutom har vi inte kunnat att konsekvent uppnå den elektroporering av plasmider in i regenerering stjärtfenan, fastän en föregående grupp rapporterade om den framgångsrika elektroporering av DNA i vävnaden fena 23. Slutligen har vi noterat att morfolino är bara effektivt under cirka 48 timmar efter elektroporation 21, som förbjuder användning av denna teknik i sin nuvarande form för att testa gener som är involverade i differentieringen av nya celltyper. Ytterligare tester och modifiering av förfarandet kan övervinna dessa nuvarande begränsningar.
Dessutom är det möjligt att denna teknik skulle kunna användasatt testa proteiner involverade i cellmigration från den underliggande vävnaden till blastema. Till exempel, injicerade vi och elektroporerades en kontroll morfolino i båda sidorna av flänsen (såsom beskrivits i figur 7) före amputation. Vi amputerade sedan dorsala delen av fenan omedelbart distalt om injektionen planet och vi amputerade den ventrala fenan mycket mer distalt. Vid 24 hPa, hade morfolino-positiva celler på ryggsidan migrerat från injektionsstället till överliggande såret epitel och blastema. Men det var inte fallet på den ventrala sidan (Figur 9). Detta stödjer tanken att endast de celler som ligger till grund för amputation planet delta i den regenerativa svar. Dessa data tyder också på att proteiner hypotes att krävas för cellmigration kan testas med användning av denna teknik.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Freimann Life Science Center och Center for Zebrafish forskning personal för deras vård och underhåll av zebrafisk.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Micro-injection pump | World Precision Instruments | PV830 Pneumatic PicoPump | Many different microinjection systems could be used |
Micro-manipulator | World Precision Instruments | MMJR | Right-handed (MMJL for left-handed) |
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
Needle holder | World Precision Instruments | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
Needle puller | Sutter | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |