我々は条件付きで大人のゼブラフィッシュヒレ再生時の標的タンパク質の発現をノックダウンする方法を説明します。この手法は、マイクロ注入と創傷治癒、芽の形成、再生伸長を含むフィン再生の様々な段階におけるタンパク質の役割をテストすることができ、フィン組織にアンチセンスオリゴヌクレオチドmorpholinosをelectroporatingが含まれます。
urodelesと硬骨魚の特定の種がその組織を再生成することができます。ゼブラフィッシュは、このような心1、網膜2脊髄3、視神経4、感覚有毛細胞5、フィン6として、成体組織の自発的な再生を研究するために広く使われているモデルとなっています。
ゼブラフィッシュフィンを簡単に付加形成に複数の段階を研究するために操作される比較的単純な付属品です。創傷治癒、芽の形成、およびフィンの伸長:古典的には、フィンの再生は、3つの異なる段階で特徴付けられた。フィンの一部を切断するした後、周囲の上皮は増殖および創傷を介して移行されます。 33℃で、このプロセスは、6,7(HPA、 図1B)6時間後に切断以内に発生します。別の系統から、次の、基礎となる細胞(例:骨、血、グリア、線維芽細胞)の増殖芽を形成するために細胞周期を再入力し、Wを覆う表皮は( 図1D)8 を増殖し続けてhile。芽の基部の細胞が新たな組織( 図1E)8 を形成するために、それぞれの系統に再分化するように副産物が発生します。切断のレベルに応じて、完全な再生は月に一週間で完了します。
Wntシグナル、HOX、FGF、MSX、レチノイン酸、SHH、ノッチ、BMP、およびアクチビン-β遺伝子を含む遺伝子ファミリー、多数の式は、フィンの再生9-16特定の段階でアップレギュレートされています。しかし、再生時にこれらの遺伝子とその符号化されたタンパク質の役割は、タンパク質に特異的な阻害剤が13存在しない限り、野生型タンパク質または支配を、温度感受性変異体が存在するか、またはトランスジェニック動物(いずれかを過剰発現し、評価することは困難であった陰性蛋白質)は7,12を生成されました。我々develoPED迅速かつ容易にフィン再生中の任意の遺伝子の機能をテストするための逆遺伝学的手法。
モルフォリノオリゴヌクレオチドは、広くゼブラフィッシュ、 アフリカツメガエル 、ニワトリ、マウス開発17から19の間に特定のタンパク質の損失を勉強するために使用されます。ブロックはpre-mRNAのスプライシングやmRNAの翻訳のいずれかに相補的なRNA配列を持つMorpholinosの塩基対。我々は効率的に標的タンパク質のノックダウン式に再生ゼブラフィッシュフィンにフルオレセイン-タグセンスmorpholinosを導入する方法について説明します。モルホリノは再生ゼブラフィッシュテールフィンの各芽にマイクロ注入し、周囲の細胞にエレクトロポレーションされています。フルオレセインは、モルホリノをエレクトロポし、フィン組織のモルホリノを可視化するために電荷を提供します。
このプロトコルは、回生フィンの伸長中に特定のタンパク質の役割を調べるために、条件付きタンパク質のノックダウンを可能にします。 Discussioでnは、我々は、このアプローチは、創傷治癒や芽の形成と同様に、芽の形成時の細胞移動の潜在的なマーカーの間に特定のタンパク質の役割を研究するために適応させることができる方法について説明します。
ここでは、成体ゼブラフィッシュのヒレ再生時に興味のある条件付きでノックダウンのタンパク質への強力な機能喪失のアプローチを説明します。この手法は、回生フィン伸長16、20-22の間にギャップ結合遺伝子、シグナル伝達受容体、転写因子、およびマイクロRNAを研究するために使用されています。
我々は、この技術はまた技術を適応することによって創傷治癒と芽の形成に必要な遺伝子を研究するために使用できることを期待しています。例えば、我々は注入し、前に切断します( 図7)フィンの背側半分に骨の鰭の間の空間に制御モルホリノをエレクトロポレーション。次に、射出面に直ちに遠位フィンを切断。 24 HPAは、再生のこれらの初期段階で細胞もターグできることを示し、モルホリノ標的細胞が傷上皮と芽( 図8)の両方を形成するために、遠位に移行したことを観察しeted。
テクニックはいくつか注目すべき制限があります。例えば、フルオレセインタグからの蛍光は、それが不可能な細胞内に存在するモルホリノの量と特定の細胞の表現型(すなわち、細胞増殖)と相関することができる免疫組織化学について、次の固定および処理を保持していません。前のグループは、フィンの組織23にDNAの正常なエレクトロポレーションを報告しましたが、加えて、我々は、一貫して再生尾びれにプラスミドのエレクトロポレーションを達成することができませんでした。最後に、我々はモルホリノだけ新しい細胞型の分化に関与する遺伝子をテストするために、現在の形でこのテクニックを使用して禁止している〜48時間後にエレクトロ21日に有効であることを指摘している。手順の追加のテストおよび修正は、これらの現在の限界を克服することができます。
また、この手法が使用される可能性がある基本的な組織からの芽への細胞遊走に関与するタンパク質をテストすることができます。たとえば、我々は、注入され、切断する前にフィンの両側( 図7参照)に制御モルホリノをエレクトロポレーション。次に、射出面に直ちに遠位フィンの背側半分を切断し、我々ははるかに遠位に腹びれを切断。 24 hPaで、背側モルホリノ-陽性細胞は注射部位から覆う傷上皮と芽に移行しました。しかし、それは腹側( 図9)のケースではなかった。これは、切断面を貫く唯一の細胞は再生応答に関与するという考えをサポートしています。これらのデータはまた、細胞移動に必要であることが仮説を立てたタンパク質は、この手法を使ってテストすることが示唆された。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、ゼブラフィッシュの彼らのケアとメンテナンスのためにゼブラフィッシュの研究スタッフがFreimannライフサイエンスセンター、センターに感謝します。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Micro-injection pump | World Precision Instruments | PV830 Pneumatic PicoPump | Many different microinjection systems could be used |
Micro-manipulator | World Precision Instruments | MMJR | Right-handed (MMJL for left-handed) |
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
Needle holder | World Precision Instruments | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
Needle puller | Sutter | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |