Nós descrevemos um método para condicionalmente knockdown a expressão de uma proteína alvo durante a regeneração do adulto peixe-zebra barbatana. Esta técnica envolve a micro-injecção e electroporating morpholinos oligonucleótido anti-sentido para o tecido da aleta, o que permite testar o papel da proteína em vários estágios de regeneração da barbatana, incluindo a cicatrização de feridas, a formação de blastema, e excrescência regenerativo.
Certas espécies de peixes teleósteos urodeles e pode regenerar seus tecidos. Zebrafish tornaram-se um modelo largamente utilizado para estudar a regeneração espontânea de tecidos adultos, tais como o coração 1, 2 retina, a espinal medula 3, 4 nervo óptico, as células pilosas sensitivas 5, e as aletas 6.
A barbatana peixe-zebra é um apêndice relativamente simples, que é facilmente manipulado para estudar múltiplos estágios na regeneração epimórfica. Classicamente, a regeneração da nadadeira foi caracterizada por três fases distintas: cicatrização, a formação do blastema e conseqüência fin. Após amputando parte da barbatana, o epitélio circundante prolifera e migra sobre a ferida. A 33 ° C, este processo ocorre dentro de seis horas após a amputação-(hPa, Figura 1B) 6,7. Em seguida, as células subjacentes a partir de diferentes linhagens (ex. óssea, sangue, células gliais, fibroblastos) voltar a entrar no ciclo celular para formar uma blastema proliferativa, wnquanto a epiderme sobrejacente continua a proliferar (Figura 1D) 8. Excrescência ocorre como células proximais ao blastema re-se diferenciar em suas linhagens respectivas para formar novo tecido (Figura 1E) 8. Dependendo do nível da amputação, a regeneração completa é completada em uma semana a um mês.
A expressão de um grande número de famílias de genes, incluindo Wnt, hox, FGF, MSX, ácido retinóico, shh, entalhe, BMP, e activina A-beta genes, é sobre-regulada durante fases específicas do fin regeneração 9-16. No entanto, os papéis de esses genes e suas proteínas codificadas durante a regeneração tem sido difícil de avaliar, a menos que um inibidor específico para a proteína existe 13, um mutante sensível à temperatura existe ou um animal transgénico (quer superexpressão da proteína do tipo selvagem ou um dominante -negativa de proteína) foi gerado 7,12. Nós desenped uma técnica genética reversa de forma rápida e facilmente testar a função de qualquer gene durante a regeneração fin.
Oligonucleotídeos morfolino são amplamente utilizados para estudar a perda de proteínas específicas durante o peixe-zebra, Xenopus, pintinho, eo desenvolvimento do mouse 17-19. Morpholinos pares de bases com uma sequência de RNA complementar ou bloco de splicing pré-mRNA ou a tradução do mRNA. Nós descrevemos um método para introduzir de forma eficiente de fluoresceína-etiquetados com anti-sentido morpholinos em aletas regeneração peixe-zebra para expressão knockdown da proteína alvo. O micro-morfolino é injetado em cada blastema da nadadeira em regeneração da cauda do peixe-zebra e electroporados nas células vizinhas. Fluoresceína fornece a carga para a electroporate morfolino e para visualizar o morfolino no tecido barbatana.
Este protocolo permite knockdown proteína condicional para examinar o papel de proteínas específicas durante conseqüência fin regenerativa. No Discussion, nós descrevemos como esta abordagem pode ser adaptado para estudar o papel das proteínas específicas durante a cicatrização de feridas ou formação de blastema, bem como um marcador potencial de migração celular durante a formação do blastema.
Aqui, descrevemos uma abordagem perda de função poderosa para proteínas condicionalmente knockdown de interesse durante a regeneração da nadadeira em zebrafish adulto. Esta técnica tem sido utilizada para estudar os genes junções, sinalizando receptores, fatores de transcrição e microRNAs durante conseqüência fin regenerativo 16, 20-22.
Prevemos que esta técnica pode também ser usado para estudar genes necessários para a cicatrização de feridas e formação blastema através da adaptação da técnica. Por exemplo, podemos injectar e electroporado um morfolino controlo no espaço entre os raios da aleta ósseas na metade dorsal da barbatana antes da amputação (Figura 7). Em seguida, amputado da barbatana imediatamente distal ao plano de injecção. 24 hPa, observou-se que as células morfolino-alvo tinham migrado distalmente para formar tanto epitélio da ferida e blastema (Figura 8), indicando que as células durante estas fases iniciais de regeneração pode também ser Targeted.
A técnica tem algumas limitações notáveis. Por exemplo, a fluorescência a partir da marca de fluoresceína não persiste a seguir fixação e de processamento para imuno-histoquímica, o que torna impossível para correlacionar um fenótipo celular particular (isto é, proliferação celular) com a quantidade de morfolino presente numa célula. Além disso, têm sido incapazes de atingir o consistentemente electroporação de plasmídeos para a barbatana da cauda de regeneração, embora um grupo anterior fez relatam a electroporação bem sucedida de DNA em fin tecido 23. Finalmente, observamos que o morfolino só é eficaz para ~ 48 horas de eletroporação pós 21, que proíbe o uso desta técnica na sua forma actual para testar genes envolvidos na diferenciação de tipos de células novas. Testes adicionais e modificação do procedimento pode ultrapassar estas limitações actuais.
Além disso, é possível que esta técnica pode ser utilizadapara testar proteínas envolvidas na migração de células do tecido subjacente ao blastema. Por exemplo, podemos injectar e electroporado um controlo morfolino em ambos os lados da barbatana (como descrito na Figura 7) antes da amputação. Em seguida, amputada na metade dorsal da nadadeira imediatamente distal ao plano de injecção e que amputar a nadadeira ventral muito mais distal. Aos 24 hPa, as células morfolino-positivos no lado dorsal tinha migrado a partir do local de injecção para o epitélio da ferida sobrejacente e blastema. No entanto, esse não era o caso no lado ventral (Figura 9). Isso apóia a idéia de que apenas as células que sustentam o plano de amputação participam da resposta regenerativa. Estes dados também sugerem que as proteínas hipótese de ser necessário para a migração de células pode ser testada usando esta técnica.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer à Vida Freimann Science Center e Center for Research Zebrafish pessoal para seu cuidado e manutenção do peixe-zebra.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Micro-injection pump | World Precision Instruments | PV830 Pneumatic PicoPump | Many different microinjection systems could be used |
Micro-manipulator | World Precision Instruments | MMJR | Right-handed (MMJL for left-handed) |
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
Needle holder | World Precision Instruments | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
Needle puller | Sutter | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |