Biz, koşullu yetişkin zebrabalıkları fin rejenerasyon sırasında bir hedef protein ifadesini demonte için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, mikro-enjeksiyon ve yara iyileşmesi, blastem oluşumu ve rejeneratif akıbet de dahil olmak üzere yüzgeç yenilenmesi çeşitli aşamalarında, proteinin rolünü test verir fin dokuya antisens oligonükleotid morpholinos electroporating içerir.
Urodeles ve teleost balık Belli türler kendi dokularını yenilemek olabilir. Zebra balığı, kalp 1, retina 2, omurilik 3, optik sinir 4, duyusal kıl hücreleri 5, 6 ve yüzgeçleri gibi yetişkin dokuların spontan rejenerasyon incelemek için yaygın olarak kullanılan bir modeli haline gelmiştir.
Zebra balığı yüzgeci kolayca epimorphic rejenerasyon çoklu aşamalar okumak için manipüle edilir nispeten basit bir apendiks olduğunu. Yara iyileşmesi, blastem oluşumu ve fin akıbet: Klasik olarak, yüzgeç yenilenmesi üç farklı aşamaları ile karakterize edildi. Fin parçası amputating sonra, çevredeki epitel çoğalan ve yara üzerinde geçirir. 33 ° C'de, bu süreç 6,7 (hpa, Şekil 1B) altı saat sonrası amputasyon içinde oluşur. Farklı soy (örneğin kemik, kan, glia, fibroblast) dan sonra, altta yatan hücreleri yeniden girin hücre döngüsü proliferatif blastem, w oluşturmak içinörten epidermis (Şekil 1D) 8 çoğalmaya devam Hile. Blastem proksimalinde hücrelerin yeni doku (Şekil 1E) 8 oluşturmak için kendi soy içine yeniden ayrım olarak akıbet oluşur. Amputasyon seviyesine bağlı olarak, tam bir yenilenme, bir ay bir hafta içinde tamamlanıyor.
Wnt, HOX, FGF, msx, retinoik asit, şşş, çentik, bmp ve aktivin-beta A genleri içeren gen ailelerinin çok sayıda, ifadesi yüzgeç yenilenmesi 9-16 belirli aşamalarında up-regüle olduğunu. Proteini için özel bir inhibitörü 13 bulunmadığı sürece Bununla birlikte, rejenerasyon esnasında bu genlerin ve bunların kodlanmış proteinlerin rolleri, değerlendirmek için zor olmuştur, bir ısıya duyarlı mutant mevcut ya da bir transjenik hayvanların (ya da aşırı vahşi tip proteini veya bir baskın -negatif protein) 7,12 oluşturulmuştur. Biz developed ters genetik tekniği hızlı ve kolay bir yüzgeç yenilenmesi sırasında herhangi bir genin işlevini test etmek.
Morfolino oligonükleotidler yaygın zebrabalıkları, Xenopus, civciv, fare ve gelişimi 17-19 sırasında spesifik proteinlerin kaybı incelemek için kullanılır. Blok pre-mRNA veya mRNA raptetme için iki tamamlayıcı bir RNA sekansı olan Morpholinos basepair. Biz verimli hedef proteinin Knockdown ifade yenileyici zebrabalıkları yüzgeçleri içine floresein etiketli antisens morpholinos tanıtmak için bir metodu tanımlar. Morfolino yenileyici zebrabalıkları kuyruk yüzgecinin her blastem içine mikro-enjeksiyon ve çevresindeki hücrelerin içine electroporated edilir. Floresein morfolino electroporate ve fin dokuda morfolino görselleştirme şarj sağlar.
Bu protokol rejeneratif fin akıbet sırasında spesifik proteinlerin rolünü incelemek için koşullu protein devirme izin verir. Discussio yılından, bu yaklaşım, yara iyileşmesi veya blastem oluşumu gibi blastem oluşumu esnasında hücre göçü potansiyel bir belirteç içerisinde özel proteinlerin bir rol incelemek için adapte edilebilir açıklanmıştır.
Burada, yetişkin zebrabalıkları içinde yüzgeç yenilenmesi sırasında ilgi şartlı Knockdown proteinlerine güçlü bir kayıp fonksiyon-yaklaşımını sunduk. Bu teknik, rejeneratif fin akıbet 16, 20-22 sırasında reseptörleri, transkripsiyon faktörleri ve microRNA sinyalizasyon, gap junction genlerin incelemek için kullanılmıştır.
Bu teknik aynı zamanda teknik uyarlayarak yara iyileşmesi ve blastem oluşumu için gerekli genleri çalışmak için kullanılabileceğini tahmin ediyoruz. Örneğin, enjekte ve (Şekil 7) önce amputasyon yüzgecinin dorsal yarısında kemik yüzgeç ışını arasındaki boşlukta bir kontrol morfolino electroporated. Daha sonra enjeksiyon düzlemine hemen distalinde fin ampute. 24 hpa, biz rejenerasyon bu erken aşamalarında hücreler de Targ edilebilir belirten morfolino hedefli hücreleri yara epitel ve blastem (Şekil 8) hem de oluşturmak için distale göç ettiği görülmektediryönetişimi.
Tekniği birkaç önemli sınırlamalar vardır. Örneğin, floresein etiketinden floresans imkansız bir hücrede mevcut morfolino miktarı ile belirli bir hücresel fenotip (yani hücre çoğalması) ilişkilendirmek için yapar immünhistokimya için aşağıdaki tespit ve işleme devam etmez. Bir önceki grup yüzgeci doku 23 içine DNA başarılı elektroporasyon rapor yaptı rağmen ek olarak, biz, sürekli yenilenme kuyruk içine plazmidlerin elektroporasyon ulaşmak mümkün olmuştur. Son olarak, morfolino ~ 48 saat yeni hücre türlerinin farklılaşma ilgili genler test etmek için şu anki haliyle bu tekniği kullanarak yasaklamaktadır yazılan elektroporasyon 21, sadece etkili olduğunu kaydetti var. Prosedürün Ek test ve modifikasyon bu mevcut sınırlamalar üstesinden gelebilir.
Buna ek olarak, bu yöntem kullanılabilir olması mümkündüraltta yatan doku blastem için hücre göçü ile ilgili proteinleri test etmek. Örneğin, enjekte edilir ve amputasyon öncesinde kanatçık arasında her iki tarafta (Şekil 7'de tarif) içine bir kontrol morfolino electroporated. Daha sonra enjeksiyon düzlemine hemen distalinde dorsal yüzgeç yarısı kesilmiş ve biz çok daha distale ventral fin ampute. 24 hpa anda, sırt tarafında morfolino-pozitif hücreler enjeksiyon yerinden yara örten epitel ve blastem göç etmişti. Bununla birlikte, bu ventral tarafı (Şekil 9) üzerinde söz konusu değildi. Bu amputasyon uçağın altında yatan yalnızca hücrelerin rejeneratif yanıtı katılma fikrini desteklemektedir. Bu veriler aynı zamanda hücre göçü için gerekli olduğu varsayılan proteinler bu tekniği kullanarak test edilebileceğini düşündürmektedir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar zebrabalıkları onların bakım ve onarım için Zebra balığı Araştırma personel için Freimann Yaşam Bilim Merkezi ve Merkezi teşekkür etmek istiyorum.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Micro-injection pump | World Precision Instruments | PV830 Pneumatic PicoPump | Many different microinjection systems could be used |
Micro-manipulator | World Precision Instruments | MMJR | Right-handed (MMJL for left-handed) |
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
Needle holder | World Precision Instruments | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
Needle puller | Sutter | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |