אנו מתארים שיטה תנאי מציאה ביטוי של חלבון המטרה במהלך רגנרציה דג הזברה למבוגרים סנפיר. טכניקה זו כוללת מיקרו הזרקה ו electroporating oligonucleotide morpholinos antisense לרקמת סנפיר, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של חלבון בשלבים שונים של התחדשות סנפיר, כולל ריפוי פצעים, יצירת blastema, ואת תוצאה רגנרטיבית.
מינים מסוימים של urodeles ודגים teleost יכול לחדש רקמות שלהם. דג הזברה הפכו להיות מודל נפוץ ללמוד התחדשות ספונטנית של רקמות בוגרות, כמו הלב 1, 2 הרשתית, חוט השדרה 3, עצב הראייה, 4 תאים שיער חושי 5, 6 ו סנפירים.
סנפיר דג הזברה הוא תוספת פשוטה יחסית, כי הוא לטפל בקלות ללמוד בשלבים מרובים התחדשות epimorphic. קלאסי, התחדשות סנפיר התאפיין בשלושה שלבים ברורים: ריפוי פצעים, יצירת blastema, ואת תוצאה סנפיר. לאחר קטיעת חלק סנפיר, האפיתל סביב proliferates ו נודד על פני הפצע. ב 33 מעלות צלזיוס, תהליך זה מתרחש בתוך שש שעות לאחר קטיעה (hPa, איור 1 ב) 6,7. בשלב הבא, התאים הבסיסיים של שושלות שונות (שמות עצם, דם, גליה, פיברובלסטים) להזין מחדש את מחזור התא כדי ליצור blastema שגשוג, Wבשעה שהייתי האפידרמיס שמעליה ממשיך להתרבות (איור 1D) 8. תוצאה מתרחשת כאשר התאים בקרבה blastema מחדש להתמיין שושלות של כל אחד מהם כדי ליצור רקמה חדשה (איור 1 ד) 8. תלוי ברמה של קטיעה, התחדשות מלאה ניתנת תוך שבוע עד חודש.
ביטוי במספר רב של משפחות גנים, כולל Wnt, hox, FGF, MSX, חומצה רטינואית, ששש, חריץ, BMP ו-activin בטא גנים, הוא מעלה מוסדר בשלבים מסוימים של סנפיר התחדשות 9-16. עם זאת, את התפקידים של גנים וחלבונים אלה מקודדים שלהן במהלך רגנרציה היה קשה להעריך, אלא אם כן מעכב ספציפי של חלבון קיים 13, מוטציה הטמפרטורה רגיש קיים או בעל חיים מהונדס (או overexpressing חלבון wild-type או הדומיננטית שלילי חלבון) נוצר 7,12. אנחנו develoPED טכניקה גנטית הפוכה במהירות ובקלות לבדוק את הפונקציה של הגן במהלך כל התחדשות סנפיר.
Oligonucleotides morpholino נמצאים בשימוש נרחב ללמוד אובדן חלבונים ספציפיים במהלך דג הזברה, Xenopus, אפרוח, עכבר ופיתוח 17-19. Morpholinos basepair עם רצף RNA משלים splicing או לחסום מראש mRNA או תרגום ה-mRNA. אנו מתארים שיטה יעילה להציג את fluorescein-מתויג antisense morpholinos אל סנפירי דג הזברה התחדשות לביטוי מציאה של חלבון המטרה. Morpholino הוא מיקרו מוזרק blastema כל סנפיר זנב דג הזברה התחדשות ו electroporated לתוך התאים הסמוכים. Fluorescein מספק תשלום electroporate morpholino וכדי להמחיש morpholino ברקמת הסנפיר.
פרוטוקול זה מאפשר מציאה חלבון מותנה כדי לבחון את התפקיד של חלבונים ספציפיים במהלך תוצאה סנפיר רגנרטיבית. ב Discussion, אנו מתארים כיצד גישה זו ניתן להתאים ללמוד את התפקיד של חלבונים ספציפיים במהלך ריפוי פצעים או היווצרות blastema, כמו גם סמן הפוטנציאל של נדידת תאים במהלך היווצרות blastema.
כאן, נתאר גישה חזקה אובדן-of-פונקציה תנאי חלבונים מציאה של עניין במהלך רגנרציה של סנפיר דג הזברה מבוגר. טכניקה זו נעשה שימוש כדי ללמוד צומת גנים הפער, איתות קולטנים, גורמי תעתוק, וכן מיקרו RNA במהלך תוצאה סנפיר משובי 16, 20-22.
אנו צופים כי טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את הגנים הדרושים ריפוי הפצע והיווצרות blastema ידי התאמת הטכניקה. לדוגמה, אנו הזריק electroporated morpholino השליטה במרחב שבין קרני סנפיר הגרומות על 1/2 של סנפיר הגב לפני קטיעה (איור 7). אנחנו קטוע אז סנפיר דיסטלי מיד למטוס ההזרקה. 24 hPa, צפינו כי morpholino במיקוד התאים נדדו distally להקים גם אפיתל הפצע blastema (איור 8), המציין כי תאים בשלבים הראשונים של התחדשות ניתן טארגeted.
הטכניקה יש כמה מגבלות בולטות מעט. כך, למשל, הקרינה מ תג fluorescein לא מתעקש קיבוע עיבוד הבאה ועל אימונוהיסטוכימיה, מה שהופך את זה בלתי אפשרי לקשר בין פנוטיפ הסלולר בפרט (כלומר ריבוי תאים) עם כמות של morpholino הנוכחי בתא. בנוסף, אנו לא הצליחו באופן עקבי להשיג את electroporation של פלסמידים לתוך סנפיר הזנב התחדשות, אם כי הקבוצה הקודמת לא לדווח electroporation מוצלח של ה-DNA לתוך רקמת הסנפיר 23. לבסוף, יש לנו לציין כי morpholino הוא יעיל רק עבור 48 שעות ~~~HEAD=NNS electroporation הודעה 21, האוסר על שימוש בטכניקה זו במתכונתה הנוכחית לבדיקת גנים המעורבים בידול של סוגי תאים חדשים. בדיקות שינוי נוסף של ההליך עשוי להתגבר על המגבלות האלה הנוכחי.
בנוסף, ייתכן כי טכניקה זו יכולה לשמשכדי לבדוק את החלבונים המעורבים נדידת תאים מרקמות הבסיס כדי blastema. לדוגמה, אנו הזריק electroporated השליטה morpholino לתוך שני הצדדים של סנפיר (כמתואר באיור 7) לפני קטיעה. אנחנו נקטעה ואז 1/2 של סנפיר הגב דיסטלי מיד למטוס הזרקת ואנחנו קטוע סנפיר הגחון הרבה יותר distally. בגיל 24 hPa, את morpholino חיובי תאים בצד הגבי נדדו מאתר ההזרקה כדי האפיתל שמעליה הפצע blastema. עם זאת, כי לא היה המקרה בצד הגחון (איור 9). זה תומך ברעיון רק את התאים העומדים בבסיס מטוס קטיעה להשתתף בתגובה רגנרטיבית. נתונים אלה מראים גם כי חלבונים שיערו להידרש נדידת תאים ניתן לבדוק באמצעות טכניקה זו.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים מדעי החיים פריימן מרכז מרכז צוות מחקר דג הזברה לטיפול שלהם ותחזוקה של דג הזברה.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Micro-injection pump | World Precision Instruments | PV830 Pneumatic PicoPump | Many different microinjection systems could be used |
Micro-manipulator | World Precision Instruments | MMJR | Right-handed (MMJL for left-handed) |
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
Needle holder | World Precision Instruments | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
Needle puller | Sutter | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |