우리는 조건부 성인 zebrafish 지느러미 재생 중에 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 마이크로 주사와 상처 치유, 아체 형성 및 재생 파생물을 포함하여 지느러미 재생의 다양한 단계에서 단백질의 역할을 테스트하고 있습니다 지느러미 조직,에 안티 센스 oligonucleotide의 morpholinos를 electroporating을 포함한다.
urodeles 및 teleost 생선의 일부 종족은 그들의 조직을 재생하실 수 있습니다. Zebrafish는 심장 1, 망막 2, 척수 3, 시신경 4, 감각 세포 5, 지느러미 6 등 성인 조직의 자발적인 재생을 연구하기 위해 널리 사용되는 모델이되었습니다.
zebrafish 지느러미는 쉽게 epimorphic 재생에 여러 단계를 공부하기 위해 조작되는 비교적 간단한 부위요입니다. 상처 치유, 아체 형성하고, 지느러미 파생물 : 고전, 지느러미 재생은 세 개의 서로 다른 단계의 특징되었습니다. 지느러미의 일부를 자르기 후, 주변의 상피는 proliferates과 상처를 통해 마이 그 레이션합니다. 33 ° C에서이 프로세스는 6,7 (고전력 증폭기, 그림 1B) 육시간 포스트 절단 내에 발생합니다. 다른 lineages (예 뼈, 피, glia, fibroblast)에서 다음, 기본 전지는 다시 입력해야 세포주기 proliferative 아체, W를 형성overlying의 표피는 (그림 1D) 8 분아 따위에 의해 중식 계속 hile. 아체에 근위 세포가 새로운 세포 (그림 1E) 8을 형성 각각 lineages로 다시 차별화로 가지가 발생합니다. 절단의 수준에 따라 모든 중생은 한달에 일주일 만에 완료됩니다.
wnt, hox, fgf, MSX, retinoic 산성, 쉬, 노치, BMP 및 activin – 베타 유전자를 포함한 유전자 가정의 큰 숫자의 표현이 지느러미 재생 9-16의 특정 단계 동안 최대 – 규제입니다. 단백질에 대한 특정 억제제가 13 존재하지 않는 그러나, 재생하는 동안이 유전자와 그 인코딩된 단백질의 역할은 평가하기 어려울되었습니다, 온도에 민감한 돌연변이가 존재하거나 유전자 변형 동물 (중 overexpressing은 야생 형 단백질 또는 지배 – 부정적인 단백질)은 7,12가 생성되었습니다. 우리 developed는 반대로 유전 기법을 빠르고 쉽게 지느러미 재생 중에 어떤 유전자의 기능을 테스트합니다.
Morpholino의 oligonucleotides 널리 zebrafish, Xenopus, 여자, 및 마우스 개발 17-19시 특정 단백질의 손실을 공부하는 데 사용됩니다. 블록 사전 mRNA의 접합 또는 mRNA 번역 중으로 보완 RNA 시퀀스로 Morpholinos의 basepair. 우리는 효율적으로 타겟 단백질의 분해가되는 표현까지 재생 zebrafish의 지느러미로 플루오레신 태그가 추가된 안티 센스 morpholinos을 소개하는 방법을 설명합니다. morpholino는 재생 zebrafish 꼬리 지느러미의 각 아체에 마이크로 주입 및 주변 세포에 electroporated있다. 플루오레신는 morpholino을 electroporate하고 지느러미 조직에서 morpholino을 시각화하기 위해 요금을 제공합니다.
이 프로토콜은 재생 지느러미 가지 중 특정 단백질의 역할을 검토하는 조건부 단백질 분해를 허용합니다. Discussio에서N, 우리는이 접근 방식은 상처 치유 또는 아체 형성뿐만 아니라, 아체 형성시 세포 이주의 잠재적인 마커 중에 특정 단백질의 역할을 공부하고 적응하는 방법을 설명합니다.
여기서는 성인 zebrafish의 지느러미 재생 중에 관심 조건부 최저의 단백질에 대한 강력한 손실 함수 접근법을 설명합니다. 이 기술은 재생 지느러미 파생물 16, 20-22시 수용체, 전사 요인과 microRNAs 신호, 갭 접합 유전자를 연구하는 데 사용되었습니다.
우리는이 기법도 기법을 채택하여 상처 치유와 아체 형성에 필요한 유전자를 연구하는 데 사용될 수 있다고 기대하고 있습니다. 예를 들어, 우리는 주입하고 (그림 7) 이전에 절단까지 지느러미 지느러미 이분의 일에 골질 지느러미 선 사이의 공간에서 컨트롤 morpholino을 electroporated. 그러면 주사 비행기로 즉시 말초 지느러미를 절단. 24 고전력 증폭기, 우리는 중생의 이러한 초기 단계 동안에 세포는 또한 targ 수 나타내는 morpholino 타겟 세포가 상처의 상피와 아체 (그림 8)을 모두 형성 distally 마이 그 레이션 것을 관찰eted.
기술은 몇 가지 중요한 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 플루오레신 태그의 형광은 불가능 세포에 존재 morpholino의 금액으로 특정 세포 표현형 (예 : 세포 증식) 신원을 확인하도록하게 immunohistochemistry을 위해 다음과 같은 고정 및 처리를 유지하지 않습니다. 이전 그룹 지느러미 조직 23로 DNA의 성공적인 electroporation을 신고했지만 이외에도, 우리는 일관되게 재생 꼬리 지느러미에 plasmids의 electroporation을 달성하지 못하고 있어요. 마지막으로, 우리는 morpholino가 ~ 48시간 새로운 세포 유형의 분화에 관련된 유전자를 테스트하기 위해 현재의 형태로이 기술을 사용 금지 포스트 electroporation 21에만 효과가 있다고 지적했습니다. 절차의 추가적인 테스트와 수정이 현재의 한계를 극복 있습니다.
또한,이 기술이 사용될 수있는 가능성이기본 조직에서 아체까지 셀 마이 그 레이션과 관련된 단백질을 테스트합니다. 예를 들어, 주입 및 절단 이전 지느러미의 양쪽합니다 (그림 7에 설명되어)로 제어 morpholino을 electroporated. 그러면 주사 비행기로 즉시 말초 지느러미 지느러미 절반을 절단하고 우리는 훨씬 더 distally 복부 지느러미를 절단. 24 고전력 증폭기에서 지느러미쪽에 morpholino-긍정 세포 주사 사이트에서 overlying 상처의 상피와 아체로 마이 그 레이션했다. 그러나, 복부 측면 (그림 9)에서 사건 아니었어요. 이것은 절단 평면을 기초에만 세포가 재생 반응에 참여한다는 생각을 지원합니다. 이러한 데이터는 또한 세포 마이 그 레이션 요구하는 가상 단백질이이 기술을 사용하여 테스트할 수있는 것이 좋습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자 zebrafish 그들의 관심과 유지 보수를 위해 Zebrafish 연구 직원 Freimann 생명 과학 센터와 센터를 감사드립니다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Micro-injection pump | World Precision Instruments | PV830 Pneumatic PicoPump | Many different microinjection systems could be used |
Micro-manipulator | World Precision Instruments | MMJR | Right-handed (MMJL for left-handed) |
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
Needle holder | World Precision Instruments | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
Needle puller | Sutter | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |