Ex vivo Mimicry den normala respektive onormala mänskliga Hematopoiesis
Summary
En 3D-odlingssystem för hematopoies beskrivs med humant navelsträngsblod och leukemiska benmärgsceller. Metoden baseras på användningen av en porös syntetisk polyuretan byggnadsställning belagd med extracellulära matrisproteiner. Detta ställningen är anpassningsbar för att rymma en mängd olika celler.
Abstract
Hematopoietiska stamceller kräver en unik mikromiljö för att upprätthålla bildning blodkroppar 1; den benmärg (BM) är en komplex tredimensionell (3D) vävnad vari hematopoies regleras genom att spatialt anordnade cellulära mikromiljöer benämnd nischer 2-4. Organisationen av BM nischer är avgörande för funktionen eller dysfunktion av normal eller malign BM 5. Därför är en bättre förståelse för in vivo mikromiljön med hjälp av en ex vivo mimicry skulle hjälpa oss klarlägga molekylära, cellulära och microenvironmental bestämningsfaktorer leukemogenesis 6.
För närvarande är hematopoetiska celler odlas in vitro i tvådimensionella (2D) vävnadsodlingskolvar per brunn-plattor 7 som kräver antingen samodling med allogena eller xenogena stromaceller eller tillsats av exogena cytokiner 8. Dessa betingelser är artificiella och skiljer sig från in vivo- </em> mikromiljö genom att de saknar 3D cellulära nischer och utsätta cellerna för onormalt höga cytokiner koncentrationer som kan resultera i differentiering och förlust av pluripotens 9,10.
Häri presenterar vi ett nytt 3D-ben-systemet benmärg kultur som simulerar in vivo 3D tillväxt miljön och stöder multilinjär hematopoes i avsaknad av exogena tillväxtfaktorer. Det mycket porösa byggnadsställning som används i detta system tillverkat av polyuretan (PU), underlättar hög densitet celltillväxt över en högre specifik ytarea än den konventionella monolagerkultur i 2D 11. Vårt arbete har visat att denna modell stöds av tillväxten av humant navelsträngsblod (CB) mononukleära celler (MNC) 12 och primära leukemiceller i frånvaro av exogena cytokiner. Denna nya 3D mimicry ger en livskraftig plattform för utveckling av en människa experimentell modell för att studera hematopoes och att utforska nya behandlingar för leukemi.
Protocol
Discussion
Ex vivo 3D odlingssystemet som presenteras här ger oss möjlighet att skapa en 3D-biomimicry av hematopoes som rekapitulerar den ursprungliga BM arkitekturen och cellulära fenotyp oberoende av exogena cytokiner. 3D-modellen ger strukturen och mikromiljön som möjliggör normala och onormala hematopoietiska celler att proliferera under förhållanden som liknar de som påträffas in vivo.
Valet av det polymera byggnadsställningsmaterial representeras ett kritiskt steg i …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av Richard Thomas Leukemi fonden, Lady Tata Memorial Trust, Northwick Park Hospital Leukemi Research Trust Fund och National Institute of Health Research (NIHR), Storbritannien.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue No |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 |
| PBS | Gibco | 14190-094 |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 |
| MTS | Promega | G3580 |
| Glutaraldehyde | Fluka Biochemika | 49624 |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10108-165 |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32272 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 |
| CD45-FITC | BD Pharmigen | 74895 |
| CD71-PE | BD Pharmigen | 555537 |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Pharmigen | 555570 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
References
- Orkin, S., Zon, L. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Spradling, A., Drummond-Barbosa, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. J Biosci. Bioeng. 100, 28-35 (2005).
- Lo Celso, C. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Mantalaris, A., Bourne, P., Wu, J. Production of human osteoclasts in a three-dimensional bone marrow culture system. Biochem. Eng. J. 20, 189-196 (2004).
- Placzek, M. Stem cell bioprocessing: fundamentals and principles. J. R. Soc. Interface. 6, 209-232 (2009).
- Dexter, T., Testa, N., Prescott, D. . Methods in Cell Biology. 14, 387-405 (1976).
- Piacibello, W. Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplification vs proliferation and differentiation. Leukemia. 12, 718-727 (1998).
- Yoshida, T., Takagi, M. Cell processing engineering for ex vivo expansion of hematopoietic cells: a review. Biochemical Engineering Journal. 20, 99-106 (2004).
- Lim, M. Intelligent bioprocessing for haemotopoietic cell cultures using monitoring and design of experiments. Biotechnol. Adv. 25, 353-368 (2007).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Panoskaltsis, N. The development of a three-dimensional scaffold for ex vivo biomimicry of human acute myeloid leukaemia. Biomaterials. 31, 2243-2251 (2010).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Aqel, N., Panoskaltsis, N. Long-term cytokine-free expansion of cord blood mononuclear cells in three-dimensional scaffolds. Biomaterials. 32, 9263-9270 (2011).
- Safinia, L., Datan, N., Hohse, M., Mantalaris, A., Bismarck, A. Towards a methodology for the effective surface modification of porous polymer scaffolds. Biomaterials. 26, 7537-7547 (2005).
