Summary
Un sistema de cultivo en 3D para la hematopoyesis se describe utilizando sangre del cordón umbilical humano y células leucémicas de médula ósea. El método se basa en el uso de un poliuretano poroso sintético andamio revestido con proteínas de matriz extracelular. Este andamio es adaptable para acomodar una amplia gama de células.
Abstract
Las células madre hematopoyéticas requieren un microambiente único fin de mantener una formación de células sanguíneas, la médula ósea (MO) es un complejo de tres dimensiones (3D) del tejido hematopoyesis en el que se regula por espacialmente organizadas microambientes celulares llamado nichos de 2-4. La organización de los nichos BM es crítica para la función o disfunción de lo normal o maligno BM 5. Por lo tanto una mejor comprensión del microambiente en vivo utilizando una mímica ex vivo nos ayudaría a aclarar los determinantes moleculares, celulares y microambientales de leucemogénesis 6.
En la actualidad, las células hematopoyéticas se cultivan in vitro en frascos de cultivo de dos dimensiones (2D) de tejidos o bien placas 7 que requieren ya sea co-cultivo con alogénica o xenogénica las células del estroma o la adición de citoquinas exógenas 8. Estas condiciones son artificiales y difieren de la in vivo 9,10.
Aquí, presentamos una novela de la médula ósea en 3D sistema de cultivo que simula el ambiente in vivo el crecimiento en 3D y es compatible con la hematopoyesis multilinaje en ausencia de factores de crecimiento exógenos. El altamente porosa andamio utilizado en este sistema de poliuretano (PU), facilita la alta densidad crecimiento celular a través de un área de superficie específica mayor que el cultivo en monocapa convencional en 2D 11. Nuestro trabajo ha indicado que este modelo apoyado el crecimiento de sangre de cordón umbilical humano (CB), las células mononucleares (MNC) 12 y primarios células leucémicas en la ausencia de citoquinas exógenas. Esta novela mímica 3D proporciona una plataforma viable para el desarrollo de un modelo humano experimental para estudiar la hematopoyesis y para explorar nuevos tratamientos para la leucemia.
Protocol
1. Andamios Fabricación y Bio-funcionalización de los Andamios
- Para fabricar andamios de PU (tamaño de poro 100-250 mm, porosidad 90-95%) en forma de discos de Petri, utiliza la separación de fase inducida térmicamente 13 proceso mediante la preparación de una solución de polímero (5% en peso en dioxano), seguido por congelación y posterior sublimación de disolvente (Figura 1A).
- Cortar el disco andamio en cubos de 0,5 x 0,5 x 0,5 mm antes del recubrimiento con proteínas ECM (Figura 1B).
- Pre-húmedos los andamios por inmersión en etanol (70%) durante 1 minuto y luego transferir en tampón fosfato salino (PBS) durante 20 min. Luego se centrifuga durante 10 minutos a 3630 xg y añadir la solución de proteína.
- Centrifugar los andamios en la solución de proteína a 1420 xg durante 20 minutos.
- Con el fin de desbloquear los poros de la superficie, y permitir que las células sembradas a penetrar más profundamente en el andamio, centrifugar los andamios una vez más a 910 g durante 10 minutosen PBS.
- Esterilizar los andamios utilizando una combinación de exposición de 8 min a 230 V, 50 Hz, 0,14 Una lámpara de rayos UV, con la inmersión durante 2 h en etanol (70%). Después de eso, lavar los andamios dos veces en PBS antes de añadir modificado por Iscove Medio de Dulbecco (IMDM) suplementado con suero fetal bovino al 30% (FBS) y 1% de penicilina y estreptomicina (P / S). Coloque los andamios en un incubador humidificado durante 3 días a 37 ° C y 5% de CO 2 antes de su uso. Andamios estériles se colocan en unos 24 placas de cultivo de tejidos bien (un andamio por pocillo).
2. Aislamiento de células mononucleares y de siembra de andamios
- Extraer humano MNC de sangre de cordón o leucémicas muestras de médula ósea, utilizando Ficoll-Paque centrifugación en gradiente de densidad (35 min a 1500 rpm) (Figura 1C).
- Volver a suspender las multinacionales en IMDM que contiene 30% de SFB y 1% P / S.
- 100μl de semillas de suspensión de CMN (2 x 10 6 células / andamio) sobre los andamios utilizando una pipeta de microorganismos.
- Incubar las células sembradas a 37 ° C por debajo del 5% de CO 2 durante 10 minutos para que las células se asientan en los andamios.
- Llenar cada pocillo con 1,5 ml de IMDM que contenía 30% de FBS y 1% P / S y el lugar y placas en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 para la duración del experimento.
- Los andamios sembrados sufren a diario el cambio de todos los medios de comunicación.
3 en la proliferación celular in situ y Morfología:. MTS, SEM y Cytospins
- Ensayo MTS: Eliminar de la cultura de las Naciones Unidas un cabeza de serie y dos andamios sin semillas y colocarlas en un lugar limpio 24 nuevo pozo de la placa. Añadir 1 ml de medio y 200 l de la solución de MTS y se incuba durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Tomar 8 x 100 muestras l del sobrenadante, coloque en una placa de 96 pocillos y la absorbancia medida a 490 nm utilizando un lector de microplacas.
- Microscopía electrónica de barrido (SEM): En diferentes puntos de tiempo de ºla cultura e, quitar los andamios sembrados con las multinacionales de los medios de comunicación, y fijar con PBS-tampón 2,5% solución de glutaraldehído durante 40 min a 4 ° C, lavar dos veces con PBS.
- Deshidratadas los andamios en una serie graduada de etanol (25, 50, 70, 80, 90, 95, y 100%), cada uno durante 10 minutos y seca en un ambiente aséptico durante 4 horas.
- Especímenes sección y luego por pulverización catódica capa de oro en una atmósfera de argón durante 2 minutos antes de la evaluación SEM, utiliza un voltaje de aceleración de 20 kV.
- Cytospins: Recoger 2,0 x 10 4 células / diapositivas aspirando las células del andamio en diferentes puntos de tiempo en la cultura.
- Centrifugar las células sobre un portaobjetos de vidrio durante 3 min a 1500 rpm.
- Mancha de las diapositivas con Wright-Giemsa modificada y observar mediante un microscopio óptico. F-ver Soft Imaging System se puede utilizar para tomar fotografías.
- Lavar los portaobjetos antes de la observación al microscopio.
- M ultiphoton análisis: andamios fijos en diferentes puntos de tiempo con el vapor de etanol (70%) durante la noche y luego secar y almacenar a -20 ° C hasta su posterior análisis. Antes de la visualización de imágenes a la sección de microscopio multifotónica el andamio a 30 micras de espesor, diapositivas y húmedo con PBS.
- Bloque las células sembradas en PBS con suero fetal bovino al 10% durante 30 min a temperatura ambiente.
- Incubar los andamios de la noche a 4 ° C en la oscuridad con una dilución 1:50 de anticuerpo monoclonal primario: el ratón anti CD71 humana.
- Lavar las muestras tres veces en PBS y se tiñen con el anticuerpo secundario: anti-ratón Alexa Fluor 488 durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lávese las muestras tres veces con PBS y observar con un microscopio confocal con una emisión de agua lente objetivo x60.
- Fluoróforo Alexa Fluor 488 se excita a 488 nm por el láser pulsátil. Volocity 5.3.2 software puede ser utilizado para el análisis de la imagen posterior.
- Antes del análisis celular en el citómetro de flujo (CF), identificar a las células de interés con los correspondientes anticuerpos de inmunofluorescencia para la detección. Una serie de muestras se preparan de acuerdo con los anticuerpos seleccionados para la detección. Para la detección MNC la siguiente combinación de anticuerpos se utilizan: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5.
- Aspirar las células del andamio en diferentes puntos de tiempo y centrifugar. Disolver un pellet de células de alrededor de 1x10 6 células en 100 l tampón FC (PBS + 0,1% de azida de sodio) y se añaden 10 l de cada tinte fluorescente anticuerpo. Se incuban las células durante 30 min a 4 ° C, se lava dos veces con PBS y finalmente volver a suspender en tampón de FC.
- Coloque la muestra en el citómetro de flujo manchado con el control de isotipo para establecer la "negatividad" de la expresión de anticuerpos y calibrar los canales de detección con el control de citómetro de flujo.
- Lea el teñido de la muestra w on los tres anticuerpos diferentes y finalmente representar los datos en el uso del software WinList.
5. Los resultados representativos
Un ejemplo de la cinética de crecimiento hematopoyéticos celulares sin la adición de factores de crecimiento exógenos se muestra en la Figura 2. Debido a la naturaleza heterogénea de la hematopoyesis, dos células diferentes: normales y anormales de las células hematopoyéticas se ilustran. En la Figura 2A, la proliferación celular de CBMNC humana es evidente después de 28 días de cultivo. Figura 2B muestra la cinética de crecimiento en el mimetismo con las células leucémicas primarias. La proliferación celular se evaluó mediante el ensayo MTS que mide la actividad metabólica celular en relación a la absorbancia. En ambos casos, las células proliferan y se estableció en el modelo. Las diferencias en la cinética de crecimiento se observan; células hematopoyéticas normales establecen la cultura más rápido que las células leucémicas.
_content "> La morfología de las células recolectadas incluso después de 28 días de cultivo en ausencia de factores de crecimiento exógenos era típico de las células hematopoyéticas normales (Figura 3A) y células leucémicas (Figura 3B). secciones centrales de los andamios se analizaron por SEM después los andamios se han retirado de la cultura y mostró la propagación de las células sembradas en todo el andamiaje, estableciéndose en grupos y en "como nicho de" estructuras (Figura 3 A 'y B'). La figura C muestra el tamaño del poro y la distribución en una cabeza de serie andamio utilizado como control. microscopía multifotónica después de 28 días fue utilizado para resaltar la distribución de las células dentro del andamio 3D in situ y se demostró la presencia de islas eritroide en las secciones centrales del andamio (Figura 4) por la expresión del marcador CD71 que es positivo en eritroblastos. Esto demuestra la importancia de la madurez y las células maduran duanillo de la eritropoyesis. Finalmente, los gráficos de citometría de flujo de la siembra células antes muestra la diferencia en el fenotipo de las células hematopoyéticas, donde la figura 5A representa células hematopoyéticas normales: CBMNCs humanos y la Figura 5B ilustra anormales células hematopoyéticas: células leucémicas primarias. Los niveles de CD235a + y CD45 + que corresponde a los eritrocitos y leucocitos, respectivamente, son más altos en la muestra normal que en la leucemia destacando el carácter hemoblastic de las leucemias.
Figura 1. Ilustración de los procesos involucrados en la fabricación de poliuretano de andamio y bio-funcionalización. A) PU se disolvió en dioxano (5% en peso) y por el proceso de separación de fases inducida térmicamente y la sublimación de disolvente posterior del andamio se produce, como se describe por Safinia et al 13. B) El disco de andamio se corta into Los cubos de 0,5 x 0,5 x 0,5 mm y luego revestida por centrifugación con extra de matriz extracelular (ECM) de proteínas. C) MNC se extraen del cordón umbilical humano CB o de la aspiración BM mediante centrifugación en gradiente de densidad y sin semillas (2x10 6 células / andamio) en los andamios de poliuretano con una micropipeta.
. Figura 2 La proliferación celular medido mediante el ensayo de MTS: A) utilizando sangre del cordón umbilical humano multinacionales; B) con las células leucémicas primarias. Las columnas muestran el crecimiento de las células con el tiempo cuando se siembran en la PU andamios sin la adición de citoquinas exógenas.
Figura 3: La morfología celular y la distribución de alrededor de los andamios utilizando cytospins, scanning de electrones micrografías. (AB) Representante de Wright-Giemsa cytospins manchada de un cable de células sanguíneas mononucleares) recogidos de los andamios de poliuretano después de 28 días de cultivo, y B) del hueso aspiración células leucémicas recogida de los andamios de poliuretano después de 14 días de cultivo. Ambos experimentos se llevaron a cabo en condiciones de citoquinas libre. (A'-B ') Representante secciones centrales de las micrografías PU andamio SEM de una' cabeza de serie) de sangre de cordón multinacionales y "B) células leucémicas después de haber sido cultivadas durante 28 días, y C) de control de andamiaje sin células.
Figura 4. Micrografía fotones de una cabeza de serie PU andamio con sangre del cordón umbilical después del 28 d las multinacionales en la cultura y se tiñen con el marcador CD71 eritroide.
la figura 5. de citometría de flujo 3D Dot-parcelas teñidos para CD45, CD71 y los marcadores de superficie CD235a de expresión. El isotipo de control obtenida se presenta también para la comparación de la intensidad de fluorescencia relativa. El panel A muestra las células mononucleares de sangre de cordón umbilical positivos para los marcadores anteriores, el Panel B muestra células leucémicas humanas primarias.
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Discussion
El sistema de cultivo ex vivo en 3D que aquí se presenta, nos permite establecer una biomimética 3D de la hematopoyesis que resume la arquitectura original BM y fenotipo celular independiente de citocinas exógenas. El modelo 3D proporciona la estructura y el microambiente que permite a las células hematopoyéticas normales y anormales de proliferar en condiciones similares a las encontradas in vivo.
La selección del material de soporte polimérica representa un paso crítico en el diseño de la biomimética. Ventajas importantes en biomateriales se han llevado a un creciente interés en los polímeros que imitan el ambiente in vivo, proporcionando la arquitectura necesaria, las propiedades estructurales y bioseñales necesarios. Los polímeros deben cumplir con los requisitos mínimos indispensables para su aplicación en biomedicina porque siempre están en contacto directo con las células vivas, que son sensibles a su entorno inmediato. En general, una iacuerdo andamio debe ser biocompatible, altamente porosa, con suficiente fuerza mecánica para mantener una estructura definida 3D, alta superficie específica por la relación de volumen y la fabricación reproducible. PU comprende todas aquellas propiedades juntos, aunque la alta porosidad y resistencia mecánica puede ser adaptado y cambiado en función de la temperatura de enfriamiento durante el proceso de TIPS. Como resultado, este biomimética puede adaptarse a otros tipos de células, aumentando o disminuyendo el tamaño de poro y porosidad según sea necesario.
El andamio en este experimento se recubre con el colágeno de tipo ECM proteína I; esta proteína, junto con otras proteínas ECM se ensayaron previamente con nuestro modelo 3D 11. Esto demostró que el colágeno tipo I se aceleró la adhesión celular y fue seleccionado por esa razón. El revestimiento puede ser modificado mediante el uso de diferentes proteínas ECM en función del tipo de células que están siendo estudiados. La ventaja de incorporar las proteínas ECM a la sintética i andamioss que no sólo proporcionan la secuencia de células de unión para la adhesión celular, pero también ofrecen interacciones secundarias con otras proteínas ECM y las interacciones con los factores de crecimiento que estabilizan la unión de las células así mejorando la adhesión celular, lo que resulta en un mejor crecimiento celular y la maduración.
Numerosos estudios se han realizado sobre la hematopoyesis ex vivo utilizando tanto en 2D como en 3D y sistemas, y todos ellos incluyen la adición de concentraciones anormalmente altas de citocinas exógenas. Estos estudios han ayudado a elucidar los determinantes moleculares de la hematopoyesis, pero los elementos celulares y microambiental integrales para este proceso han sido difíciles de descifrar sobre la base de las limitaciones de estas mismas técnicas.
El método descrito aquí, una biomimetismo de la BM hecha de un andamio polimérico altamente poroso acoplado con ECM revestimiento es óptima para sostener y estabilizar el crecimiento de la hematopoyesis normal y anormal sinla necesidad de cualquier adición de citoquinas. La mímica soporta multi-lineal de la hematopoyesis que el sistema de adecuado para su uso como plataforma para el descubrimiento de fármacos y el estudio científico sobre los mecanismos de la hematopoyesis ex vivo normal y anormal.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Fondo de Richard Thomas, la leucemia, la señora Tata Memorial Trust, el Northwick Park Hospital Leucemia Fondo de Investigación del Fideicomiso y el Instituto Nacional de Investigación en Salud (NIHR), Reino Unido.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-094 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MTS | Promega Corp. | G3580 | |
| Glutaraldehyde | Fluka | 49624 | |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 10108-165 | |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-32272 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| CD45-FITC | BD Biosciences | 74895 | |
| CD71-PE | BD Biosciences | 555537 | |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Biosciences | 555570 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
References
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