En roman high-throughput Metoden er beskrevet som gør det muligt at afsløre og relative kvantificering af små RNA og mRNA udtryk fra enkelt bakterieceller ved hjælp af Locked Nucleic Acid sonder og flowcytometri-fluorescens<em> In situ</em> Hybridisering.
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er en kraftfuld teknik, der bruges til at registrere og lokalisere specifikke nukleinsyresekvenser i den cellulære miljø. For at øge gennemløb, kan FISH kombineres med flowcytometri (flow-FISH) for at muliggøre påvisning af målrettede nukleinsyresekvenser i tusindvis af de enkelte celler. Som et resultat tilbyder flow-FISH en klar fordel i forhold til lysat / ensemble-baserede nukleinsyre metoder til påvisning, fordi hver celle er behandlet som en uafhængig observation, og dermed tillader stærkere statistiske og varians analyser. Disse egenskaber har bedt om brugen af FISH og flow-FISH metoder i en række forskellige applikationer og nytten af disse metoder er blevet påvist i telomer længde beslutsomhed 1,2, cellulære identifikation og genekspression 3,4, overvågning viral formering i inficerede celler 5, og bakterielle samfund analyser og tælling6.
Traditionelt har de særlige forhold, FISH og flow-FISH metoder blevet bibringes i form af DNA-oligonukleotid sonder. For nylig har dog udskiftning af DNA-oligonukleotid sonder med nukleinsyre-analoger som fisk og flow-FISH prober øgede både følsomheden og specificiteten af hver teknik på grund af de højere smeltepunkter (T m) af disse analoger til naturlig nukleinsyrer 7,8 . Locked Nucleic Acid (LNA) sonder er en type af nukleinsyre analog, der indeholder LNA-nukleotider spiked igennem en DNA-eller RNA-sekvens 9,10. I kombination med flow-FISH, har LNA prober tidligere været vist at overgå konventionelle DNA-sonder 7,11 og med succes er blevet brugt til at detektere eukaryote mRNA 12 og viral RNA i mammale celler 5.
Her kan vi udvide denne mulighed og beskrive en LNA flow-FISH metode, som tillader specifikke påvisning af RNA i bakterielle celles (Figur 1). Konkret er vi interesserede i at påvisning af små ikke-kodende regulerende RNA (Srna), som har høstet stor interesse i de seneste par år, da de har vist sig at fungere som vigtige lovgivningsmæssige elementer i mange kritiske cellulære processer 13. Der er dog begrænsede værktøjer til at undersøge sRNAs og de udfordringer, opdage Srna i bakterieceller skyldes til dels den relativt lille størrelse (typisk 50-300 nukleotider i længde) og lav overflod af Srna molekyler samt den generelle vanskeligheder med at arbejde med mindre biologiske celler med varierende cellulære membraner. I denne metode, beskriver vi fiksering og permeabilzation betingelser, der bevarer strukturen af bakterieceller og tillade gennemtrængning af LNA sonder samt signalforstærkning skridt, som gør det muligt for specifikke påvisning af lav tæthed Srna (Figur 2).
LNA flow-FISH-metoden præsenteres her blev brugt til at registrere udtryk for et Srna fra Gram-negative marine bakterie, Vibrio campbellii hvis udtryk er tidligere blevet bekræftet via microarray-baserede udtryk profilering og reverse transcription polymerase chain reaction 16. Til dato har vi brugt denne metode til at overvåge udtryk for en bred vifte af RNA (fx trans-kodet Srna, Srna, som modulerer protein aktivitet, riboswitches, og mRNA). Som sådan, er vi overbeviste om, at metoden er fleksibel og kan bruges til at afsløre eventuelle Srna eller mRNA target og kan være modificeret til brug i alle bakteriearter eller celletype. Hvis ændring af denne protokol er nødvendigt for andre celletyper, at den vigtigste variabel til at overveje at manipulere er permeabilization skridt. For eksempel, når ændre permeabilization betingelser, der er beskrevet her, skal ændringer i koncentrationen af lysozym og proteinase K testes. Vi fandt, at en fordobling ellertredobling mængden af lysozym og proteinase K har resulteret i væsentlige ændringer i LNA flow-FISH resultater. Desuden ved test yderligere permeabilization betingelser, bør cellerne skal analyseres for sammenklumpning celletab, og den bedst opnåelige signal til baggrundsfluorescens ratio. Omfanget af cellen sammenklumpning kan testes ved mikroskopi og / eller flowcytometri. Ved flowcytometri, er celle klumper stede som haler i en fremadrettet vs sidespredning prikplot og den korrekte permeabilization metode vil minimere denne hale effekt. Denne metode er også muligt at foretage en multiplex Srna detektion uden store ændringer i den beskrevne protokol, som yderligere LNA prober mærket med andre haptens såsom digoxigenin kunne tilføjes under hybridisering trin og derefter opdages med en anti-digoxigenin antistof og sekundært antistof-fluoroforen konjugat. I øjeblikket er den eneste begrænsning, vi har mødt med denne metode er dens manglende evne til at generere tilstrækkelig signal fra svagt expressede Srna arter og indsats i gang for at bestemme detektionsgrænsen (i absolutte antal kopier per celle).
Samlet set LNA flow-FISH-metoden giver mulighed for at måle bakteriel Srna eller mRNA udtryk på enkelt-celle-niveau i et high throughput måde at give indsigt om tilstedeværelsen og relative forekomst af en Srna arter og i hvor høj grad sit udtryk varierer i en befolkning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Office of Naval Research via US Naval Research Laboratory core midler.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Applied Biosystems/Ambion | AM9625 | |
Nuclease-free water | Applied Biosystems/Ambion | AM9932 | (not DEPC treated) |
32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15714 | Ethanol free |
Acetic acid | Acros Organics | 327290010 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | Keep desiccated |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L2879 | |
Proteinase K (20 mg/mL) | Applied Biosystems/Ambion | AM2546 | |
Formamide | Applied Biosystems/Ambion | AM9342 | Deionized, aliquot and freeze |
Dextran sulfate MW > 500,000 | Sigma Aldrich | D8906 | Aliquot 60% solution and freeze |
Denhardt’s solution 50X concentrate | Sigma Aldrich | D2532 | Aliquot and freeze |
Sodium citrate buffer 20X | Applied Biosystems/Ambion | AM9770 | |
Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL | Applied Biosystems/Ambion | AM9680 | Aliquot and freeze |
Yeast tRNA (10 mg/mL) | Life Technologies/Invitrogen | 15401-011 | Aliquot and freeze |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
5X in situ hybridization blocking solution | Vector Laboratories | MB-1220 | |
DyLight 488 streptavidin | Vector Laboratories | SA-5488-1 | |
Biotinylated anti-streptavidin | Vector Laboratories | BA-0500 | Aliquot and freeze |