1. LNA prober og eksperimentell design Design LNA sonder som er det motsatte komplettere din transkribert sRNA / mRNA eller få dem tilpasset designet på www.exiqon.com . Hvis du bruker tilpasset design alternativet, vil du vite sekvensen, men ikke LNA spiking mønster. Tilføyelsen av hver LNA rester inn i en DNA eller RNA oligonukleotid resulterer i en økning i T m på mellom to og 10 ° C for en LNA-RNA hybridisering duplex 14. Ideelt sett bør utformet LNA sondene være mellom 20-25 nukleotider i lengde (lengre prober er vanskeligere å syntetisere) og har en T m på mellom 85-90 ° C for RNA hybridisering. Etter utforme sekvensen, bruker BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi eller sammenligne sonden sekvensen til din lokale database for å sikre sonden gjelder bare for din sRNA / mRNA av interesse. Når du bestiller den LNA probe, legge til en biotin-TEG endring i 5 'enden av LNA oligonukleotid. Den biotinylation er nødvendig for post-hybridisering farging med en streptavidin-dye konjugat. Det er mulig å legge denne modifikasjonen til 3 'ende hvis nødvendig, men i tillegg til 5' enden er mindre kostbart og skal resultere i høyere avkastning. Tre negative kontroller skal inkluderes i metoden: (i) et "nei LNA 'kontroll der en LNA probe ikke er lagt under hybridisering trinnet, (ii) en' no fargestoff kontroll der LNA probe er hybridisert til target sRNA men hybridiseringen arrangementet ikke er oppdaget på grunn av fravær av fluorescerende flekken, og (iii) en "non-uttrykt sRNA / mRNA 'kontroll som utnytter en LNA sonde som mål en ikke-eksisterende eller ikke-uttrykt sRNA i orden å overvåke uspesifikk hybridisering. De spesifikke LNA probe her er komplementære til sRNA CsrB og har sekvensen 5'-biotin-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 '(LNA monomerer istore bokstaver). Etter mottak av lyofilisert LNA, resuspender med nukleasefritt vann til 50 mg / ml og lagre i 10-20 mL alikvoter ved -20 ° C. Løsninger 8% paraformaldehye (PFA), 10% eddiksyre i PBS: Bland 1 mL 32% PFA, 400 mL eddiksyre, 400 mL 10X PBS, pH = 7.4, og 2.2 mL nukleasefritt vann. For frossen alikvoter, fryse i engangsbruk alikvoter ved -20 ° C uten eddiksyre. 60% dekstransulfat: Tilsett 6,0 g dekstransulfat til en 50 mL konisk rør og tilsett vann til en endelig volum på 10 ml. Heat denne blandingen til 65 ° C i vannbad før dekstransulfat er oppløst (kan ta 1-2 timer). Ekstra vann kan trenge å bli lagt gjennom hele solubilization prosessen for å opprettholde en 10 ml volum. Delmengde 60% dekstransulfat løsning og oppbevar ved -20 ° C til bruk. 2. Fiksering Høste 1×10 8 celler av bioluminescent <em> Vibrio campbellii eller bakterier av interesse og overføre dem til en 1,5 mL mikrosentrifuge tube. Dette kvantumet av celler gir nok utgangsmaterialet for fire flow-fiskeprøver (ett bestemt LNA probe prøve og tre negative kontroller). Ekstra 1,5 mL mikrosentrifuge tube alikvoter bør samles dersom andre sRNA / mRNA arter trenger å bli testet. Pellet den bakterielle celler ved sentrifugering ved 2300 xg i fem minutter. Kast supernatanten ved pipettering og resuspender cellene i 400 mL av 1X PBS. Til denne blandingen, tilsett 400 mL av en 8% paraformaldehye (PFA) og 10% eddiksyre i 1X fosfatbufret saltvann (1X PBS) løsning, bland godt, og inkuber i 10 minutter ved 25 ° C blanding gang etter fem minutter. All inkubasjoner, med mindre annet er angitt, er utført i en oppvarmet tube holderen. Den PFA Løsningen bør være forberedt fersk eller brukt fra frosset alikvoter etter tilsetning av eddiksyre. Paraformaldehyde er en crosslinking fiksativ som helps å bevare cellemorfologi og beholde intracellulære RNA. Pellet cellene fra denne blandingen ved sentrifugering ved 4500 xg i to minutter og fjern supernatanten ved pipettering. Alle fremtidige tiltak som krever sentrifugering bør bruke de samme innstillingene (7K, 2 min). Det er viktig å merke seg at etter sentrifugering det supernatants bør fjernes ved pipettering og ikke dekantering. Vask cellene to ganger med 400 mL 1X PBS og resuspender den endelige cellepelleten i 400 mL 1X PBS. Cellene er nå løst og kan lagres ved 4 ° C i 400 mL 1X PBS i opptil syv dager. 3. Diethyl pyrocarbonate behandling Forbered 400 mL av en 0,1% løsning av diethyl pyrocarbonate (DEPC) i 1X PBS (400 mL av denne løsningen er nødvendig for hver prøve som skal testes, slik skala tilsvarende). Den DEPC Løsningen bør være forberedt frisk fra en DEPC lager. DEPC behandling inaktiverer RNases av carbethoxylation og minskerbakgrunn signal. Legg til 400 mL av 0,1% DEPC løsning til hver faste bakteriell celle prøven og bland godt med pipettering. Inkuber denne blandingen ved 25 ° C i 12 minutter. Vask cellene to ganger med 400 mL 1X PBS, pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. Fire. Permeabilization Tilsett 1,0 mg av lysozym til 1 ml Tris-EDTA buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 8,0 pH) for en 1,0 mg / ml løsning. Denne løsningen bør være forberedt frisk. Legg til 800 mL av 1 mg / ml lysozym løsning på cellene, blandes grundig ved pipettering og Inkuber ved 25 ° C i 30 minutter med sporadiske blanding. Pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. Lysozym fungerer som en permeabilization reagens ved hydrolyzing de peptidoglycan stede i bakteriell celle vegger. Utarbeide en 3,0 mikrogram / mL løsning av proteinase K i TE buffer. Denne løsningen bør være forberedt frisk fra en 20 mg / ml proteinase K lager som er lagret ved -20 ° C.Proteinase K er en serin protease som fordøyer en rekke proteiner og hjelper tilgjengelighet av sonder og reagenser til RNA. Legg til 800 mL av 3,0 mikrogram / mL proteinase K løsning til cellepelleten og blandes grundig ved pipettering. Inkuber ved 25 ° C i 15 minutter med virvling halvveis gjennom inkubering. Pellet cellene (7K, 2 min), fjern supernatanten og vask cellene gang med 400 mL 1X PBS. Etter å ha fjernet vaske supernatant, resuspender cellene i 400 mL 1X PBS og tilsett 100 mL av resuspensjon i fire nye 1,5 mL Mikrosentrifugerør. Pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. 5. Hybridisering Forbered 100 mL av hybridisering buffer (HB) for hver prøve. Den HB består av 50% formamide av volum, 10% dekstransulfat av massen (legg til 16,7 mL av 60% dekstransulfat løsning for hver 100 mL), 1X Denhardt løsning, 50 mM natriumfosfat pH 7,0,2X natriumsitrat (SSC), 20 mikrogram skåret laks sperm DNA (SSSD) og 20 mikrogram gjær tRNA. Hver av komponentene i HB har et annet formål. Formamide senker smeltetemperaturen av nukleinsyre tomannsboliger og dermed bidra med denaturering av RNA og minimere celleskader. Dekstransulfat brukes som et volum-eksklusive polymer å konsentrere sonden og øke hybridisering rate. Denhardts løsning, gjær tRNA og SSSD tjene som en blokkerende agenter for å redusere ikke-spesifikk binding. I hver av cellen resuspendering inneholder 1,5 ml Mikrosentrifugerør, tilsett 95 mL HB og 5.0 mL av sRNA / mRNA-spesifikke LNA [20 pmol av spesifikke LNA endelig konsentrasjon] eller vann (for ikke LNA negativ kontroll). For eksempel: Tube 1-95 mL HB + 5,0 mL sRNA / mRNA-spesifikk probe Tube 2-95 mL HB + 5,0 mL sRNA / mRNA-spesifikk probe (nei dye 'negativ kontroll) Tube 3-95 mL HB + 5,0 mL sRNA/ MRNA probe ('non-uttrykt sRNA / mRNA' negativ kontroll) Tube 4-95 mL HB + 5,0 mL vann (nei LNA 'negativ kontroll) Inkuber alle fire prøvene ved 60 ° C i 60 minutter. Den hybridisering Temperaturen avhenger LNA probe (s) T m og bør være innstilt på ca 30 ° C under spådd T m for RNA annealing. Både forhøyet hybridiseringen temperatur og formamide i HB sikrer denaturering av sekundær struktur sRNA eller mRNA av interesse. Seks. Post-hybridisering vasker Etter hybridisering, tilsett 1,0 mL 0.1X SSC med 0,1% Tween-20 (SSCT) til hybridisering blandingen. Dette er nødvendig for at cellene skal fjernes fra den tyktflytende hybridisering løsningen. Pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. Tilsett 200 mL av 50% formamide, 2X SSC, 0,1% Tween-20 til cellen pellets, bland godt og incubspiste i 30 minutter ved 65 ° C i en oppvarming blokk. Tilsett 1 mL 0.1X SSCT til blandingen, pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. Legg til 500 mL 0.1X SSCT til resuspender cellene og inkuberes i 40 minutter ved 65 ° C i en varme blokk. Pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. 7. Blokkering og flekker Klargjør blokkering buffer (BB) og streptavidin-dye flekker løsning. Klargjør en 1X BB løsning fra en 5X lager (kommersielt tilgjengelig, se Reagenser). For hvert sett av fire rør, forberede 1,2 ml 1X BB. Tilsett 200 mL 1X BB til cellen pellets, resuspender og inkuberes i 30 minutter ved 25 ° C. En streptavidin-konjugert fargestoff brukes til å oppdage biotinylert LNA sonder. Mens blokkering, utarbeide en løsning på 2 mikrogram / mL DyLight 488 streptavidin eller ønsket dye-streptavidin konjugat i 1X BB i 30 min (for tre prøver, gjør 300 mL). Etter incubasjon med 1X BB, pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. Tilsett 50 mL av streptavidin-dye løsning til cellen pellets, bland godt, og inkuberes i 12 minutter ved 25 ° C med konstant blanding på en vortex eller i en thermomixer. For "no fargestoff 'kontroll, tilsett 50 mL 1X-blokkering buffer bare. For resten av protokollen, beskytte rørene mot lys med aluminiumsfolie. Vask cellene gang med 500 mL 0.1X SSCT buffer og en gang med 400 mL 1X PBS med 0,1% Tween-20 (PBST). Pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. Etter den innledende streptavidin-konjugat flekker, er signalet forsterkes ved å innføre en biotinylert anti-streptavidin antistoff til streptavidin-dye konjugat og deretter beising en gang med streptavidin-dye dermed øke utgangssignal per hybridisert LNA probe (Figur 2) . Tilsett 100 mL av 1 mikrogram / mL biotinylert anti-streptavidin antistoff i 1X PBS, resuspend cellene, og Inkuber ved 25 ° C i 30 minutter med sporadiske blanding. Pellet cellene (7K, 2 min), fjern supernatanten og vask to ganger med 400 mL 1X PBST. Tilsett 50 mL av de 2 mikrogram / mL streptavidin-dye løsning til cellene, bland godt, og inkuberes i 12 minutter ved 25 ° C med konstant blanding på en vortex eller i en thermomixer. For "no fargestoff 'kontroll, tilsett 50 mL 1X-blokkering buffer bare. Vask cellene gang med 500 mL 0.1X SSCT buffer og en gang med 400 mL 1X PBST. Suspender cellene i 200 mL 1X PBST og oppbevar ved 4 ° C til den er klar for flowcytometri analyse. For mindre bakterieceller sette strømningshastighet å bremse for å redusere kjernen størrelse. I tillegg, for flowcytometere med forover scatter terskel tidsavgrensninger, må cutoff settes så lavt som mulig for å sikre små bakterielle celler oppdages. For DyLight 488 deteksjon, bør flowcytometer være utstyrt med en 488 nm laser og standard utslippfiltre for FITC. Minst 2×10 4 hendelser bør samles. For kompatibilitet med flowcytometere utstyrt med forskjellige lasere, kan andre streptavidin-konjugert fluorophores brukes til denne protokollen. 8. Representative resultater Et eksempel på celler som er faste og permeabilized effektivt er vist i flowcytometri dot plottet i Figur 3A. Ved bruk av forholdene beskrevet ovenfor for permeabilization, er cellen befolkningen små og homogen indikerer få celle aggregater. Når høyere (5 mg / ml) konsentrasjoner av lysozyme brukes, cellene er mer sannsynlig å aggregere og viser økt frem scatter verdier indikerer større partikler (Figur 3B). Et eksempel på flowcytometri data fra en vellykket LNA flow-FISH forsøket er vist i Figur 4. Histogrammet viser spesifikk påvisning av et mål sRNA sammen med tre negative kontroller."No dye 'negativ kontroll produserer minst fluorescens, etterfulgt av" no LNA' og 'ikke-uttrykte sRNA' negative kontroller. Endelig produserer prøven med sRNA-spesifikke LNA probe størst fluorescens. Når metoden og LNA prober er validert på denne måten, kan flere eksperimenter være konstruert for å overvåke endringer i sRNA signalet over tid, som svar på mutasjoner eller variert kultur forhold, etc. Figur 1. Visning av den generelle ordningen med en LNA flow-FISH eksperiment for påvisning av bakteriell sRNA. Figur 2. Farging og forsterkning av LNA flow-FISH signal. a) Hybridisering av biotinylert LNA probe. b) Farging med fluorescerende DyLight 488 streptavidin konjugat. c) Binding av biotinylert anti-streptavidin antistoff til DyLight 488 streptavidin. Antistoffet kan binde streptavidin gjennom sin antigen-bindende område eller kan være bundet av streptavidin gjennom sin biotin rester. d) forsterkning av signalet ved ytterligere farging med den fluorescerende DyLight 488 streptavidin konjugat. Figur 3. Flow cytometri dot tomter viser frem versus side scatter resultater for a) 1 mg / ml lysozyme, 3 mikrogram / mL proteinase K permeabilization og b) 5 mg / ml lysozyme, 3 mikrogram / ml proteinase K permeabilization. Figur 4. Histogram analyse av LNA flow-FISH resultatene. Den fluorescerende signal genereres fra hver prøve er vist ved de fire spor: svart – sRNA-spesifikke LNA probe; rød – "ikke-uttrykte sRNA 'negativ kontroll, blå – nei LNA' negativ kontroll; lilla -'No fargestoff "negativ kontroll.