הטכניקה לבידוד fibroblasts פורטל מהכבד עכברוש מתואר. הם כבדי perfused ו מתעכל<em> באתרו</em> עם collagenase, ואחריו<em> לשעבר vivo</em> העיכול של slurry הכבד בחירת גודל של תאים. שיטה זו מספקת האוכלוסייה הטהורה של fibroblasts פורטל ללא צורך במעבר בתרבות.
לייפת הכבד מוגדר על ידי בתצהיר יתר של תאי מטריקס ידי myofibroblasts מופעל. ישנם סימנים מקדימים מרובים של myofibroblasts בכבד, כולל stellate תאים בכבד, fibroblasts הפורטל מח עצם fibroblasts הנגזרות 1. Stellate תאים בכבד כבר למד הכי טוב, אבל fibroblasts פורטל מוכרים יותר ויותר תורמים חשובים בריכה myofibroblast, בעיקר סיסטיק המרה 2. Fibroblasts פורטל ריבוי עוברים בעקבות פציעה אפיתל המרה, שעלול לשחק תפקיד מפתח בשלבים הראשונים של המרה צלקות 3-5. שיטת בידוד fibroblasts הפורטל יאפשר במחקר במבחנה של אוכלוסייה זו התא להוביל להבנה טובה יותר של תפקיד fibroblasts פורטל משחקים סיסטיק המרה.
Fibroblasts פורטל היו מבודדים תוך שימוש בטכניקות שונות, כולל 6 תוצאה, 7 ו Liזלוף ver עם עיכול אנזימטי ואחריו מבחר בגודל 8. היתרון של מערכת העיכול ובחירת הטכניקה גודל לעומת הטכניקה תוצאה היא לתאים ניתן ללמוד ללא צורך במעבר בתרבות. כאן אנו מתארים גירסה שונה של הטכניקה המקורית שתואר על ידי קרוגלוב ו Dranoff 8 עבור בידוד של fibroblasts פורטל מהכבד עכברוש המביא אוכלוסייה טהורה יחסית של תאים ראשוניים.
Fibroblasts פורטל לשחק תפקיד חשוב סיסטיק המרה. כאן אנו מתארים שינוי של הפרוטוקול המקורי שפורסם על ידי קרוגלוב ו Dranoff 8 לבידוד fibroblasts פורטל מהכבד חולדה, המספקת דרך פשוטה לבחון את אוכלוסיית תאים במבחנה.
גישה זו משתמשת העיכול פרוטאז וגודל מבוסס הסינון. היתרון העיקרי של שיטה זו היא אוכלוסיה טהורה יחסית של תאים ניתן להשיג ללא מעבר בתרבות, המאפשר מחקר של ביטוי גנים או התנהגות התא תפקודית מספר ימים לאחר הבידוד. טכניקה זו מציעה גם אפשרות של בידוד תאים כבדי שניהם בריאים וחולים.
אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הוא עיכול אנזימטי של parenchyma הכבד. כדי להבטיח עיכול מוצלח, חשוב לוודא דם סחוט לגמרי את הכבד במהלך perfu הראשוניתשיאון על ידי וודא כי יש אפילו לחלוט הכבד. כדי להקל, ניתן להשתמש מטלית כותנה כדי לעסות בעדינות את הכבד תוך המרוססת. יתר על מערכת העיכול של parenchyma תוצאות הכבד בתשואה נמוכה של תאים קיימא, בעוד תת העיכול יקשה להפריד parenchyma הכבד מעץ המרה. מאז ההכנות של pronase יש משונות הפעילות האנזימטית בין מגרשים שונים, אופטימיזציה של כמות משתמשים עשוי להיות נחוץ כאשר יש תשואה נמוכה של תאים קיימא.
פרוטוקול זה עשוי להיות שונה עבור בידוד fibroblasts פורטל מהכבד עכבר או חולדה צעירה הכבד באמצעות קטטר קטן IV מד כדי cannulate וריד השער, להקטין את היקף פתרונות זלוף ביחס למשקל בעל החיים, ולהפחית את שיעור זלוף הכבד כ 10 mL / min.
Fibroblasts פורטל בתרבות עוברים התמיינות myofibroblastic ב 10-14 ימים, כפי שמעידים לשעבר α-SMAדיכאון 9. סמנים שונים שימשו להבחין fibroblasts לפורטל stellate תאים בכבד, כולל fibulin-2, IL-6, אלסטין, nucleoside טריפוספט diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilin-1 ו חלבונים עצביים כגון synaptophysin 2, 6, 10, 11 . מצאנו כי ואלסטין הוא סמן טוב fibroblasts הפורטל, גם לאחר התמיינות myofibroblastic, בעוד NTPDase2 אבד לאחר fibroblasts פורטל עברו תרבות אחרי כמה ימים 9. לכן, אנו בדרך כלל לאשר את הבידוד של fibroblasts פורטל ידי מכתים immunofluorescence עבור ואלסטין.
המגבלה של טכניקה זו היא, מיד לאחר בידוד פיברובלסטים הפורטל, יש חלק קטן של זיהום תאים, כולל תאים Kupffer ותאי המרה. Fibroblasts פורטל יתגבר על תאים אלה מזהמים תוך 2-3 ימים, לעומת זאת, מניב האוכלוסייה טהור יחסית (> 98%) 9.
סיNCE fibroblasts פורטל בתרבות עוברים התמיינות myofibroblastic על הפלסטיק תרביות רקמה, אנחנו בדרך כלל ללמוד תאים אלה תוך 7 ימים של בידוד. התאים נשמרים בפורטל תרבות התקשורת פיברובלסטים המכילים 10% בסרום שור עוברית, כמתואר בסעיף שיטות. עם זאת, תאים אלה ישרדו בתקשורת צמיחה המכילים 2% בסרום שור עוברית במשך כמה ימים. אנחנו בדרך כלל לא משתמשים במדיה בסרום נמוכות עד לפחות 24 שעות לאחר בידוד. לאחר fibroblasts פורטל עוברים התמיינות myofibroblastic, ניתן passaged מספר פעמים והמשיך כמו מניות הקפואים של myofibroblasts.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי NIH R01 DK05823 (כדי RGW), F32 DK083213 (כדי JWW), F30 DK081265 (כדי ALO), ועל ידי מענק מטעם פרד סוזן Biesecker מרכז ילדים כבד (כדי RGW).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |