Summary
一个从大鼠肝门成纤维细胞的分离技术。肝脏被灌注和消化
Abstract
肝纤维化是指由活化的肌成纤维细胞外基质过度沉积。有多种肝肌纤维母细胞的前体，包括肝星状细胞，门成纤维细胞和骨髓成纤维细胞1。肝星状细胞已经最好的研究，但门户网站成纤维细胞的肌纤维母细胞池的重要因素，特别是在2胆管纤维化，人们日益认识到。胆管上皮损伤门户成纤维细胞进行增殖，可能发挥在胆道疤痕3-5的早期阶段的关键作用。门户的成纤维细胞的分离方法，将允许在这个细胞群的体外研究，并导致更大的门户成纤维细胞在胆道纤维化中发挥的作用的认识。
门户网站成纤维细胞已被隔离，使用各种技术，包括生长6，7和李VER灌流酶消化大小选择8。相比生长技术的消化和大小选择技术的优点是，可以不通过文化的必要性研究细胞。在这里，我们描述了原有技术分离大鼠肝门成纤维细胞，导致在一个相对纯净的原代细胞的人口由克鲁格洛夫和Dranoff 8所述的修改后的版本。
Protocol
整个过程是在室温下进行，除非另有规定。
1。酶液的制备
- 根据表1和无菌过滤器采用0.22微米过滤器，准备酶的解决方案。直到使用时间，保持解决方案1和方案2在室温和解决方案3，4°C间。进入孤立的细胞接触的所有的解决方案和设备必须是无菌的。
2。灌注设备的制备
- 总理与HBSS中减去的Ca 2 + 2 /镁灌注系统，它已被加热到37°C。注：为了确保灌流37℃时，它在到达肝脏，在设置为37°C水浴加热的HBSS后通过灌注泵时，它会通过一个连接到水循环集到40°C（ 图1）夹套玻璃冷凝器。
- 消毒手术来OLS在70％乙醇的烧杯。
3。肝脏灌注
- 腹腔注射戊巴比妥（50-100毫克/公斤体重必要获得足够的麻醉），麻醉的成年雄性SD大鼠。
- 放置在一个塑料托盘上的仰卧姿势的动物和修复四肢用胶带托盘。
- 清洁腹部，用70％乙醇。
- 使小切口在皮肤上腹部中线。剖析皮肤上腹部大U形切离筋膜。相同的形状，暴露腹腔后的剪刀剪下腹部肌肉。
- 暴露门静脉，通过使用2个棉签轻轻移动到右侧腹部内脏。
- 通过门静脉下方的两个无菌的2.0丝线，配合松散。
- Cannulate与16-18压力表静脉导管门静脉和导管到位，确保拧紧松散TI从上一步（ 图2）ED缝合。
- 注入稀释肝素通过静脉导管肝素5000 USP HBSS中减去的Ca 2 + / Mg 2 +的 4毫升稀释的单位/毫升（1毫升）。肝脏应当灼。
- 将静脉导管灌注系统。 HBSS中减去的Ca 2 + /镁2 +在10分钟20毫升/分钟的速度灌注。横切劣势下腔静脉到肝脏允许的血液和灌注液引流。汇集血液从腹腔吐气。
- 改变灌注液，以0.3％的胶原酶溶液（500毫升的HBSS加的Ca 2 + / Mg 2 +的 2型胶原酶150毫克）和25分钟的灌注。保持肝脏的湿润与先前解剖腹部皮瓣覆盖。把培养皿盖在腹部皮瓣和区域位置热灯腹腔内的温度保持在约37°C。
4。钍的制备Ë胆管树
- 起重用钳子从腹腔取出肝，它放置在无菌组织培养与冷Leibovitz的L-15的媒体充满菜。
- 工作在组织文化的吸油烟机，肝包膜剥离，并用钳子轻轻挑逗除了肝实质。移动肝脏通过充满Liebovitz的L-15家媒体的几个特色菜，同时继续逗了实质，直到最后离开孤立的胆管树。肝实质是黄褐色的，而余下的胆管树是白色的。
- 孤立胆管树放入50毫升猎鹰10毫升青霉素/链霉素（10,000 IU / ml的青霉素和10000μg/ mL链霉素）钢管;冰离开15分钟。
5。门户的成纤维细胞组分的分离
- 放入无菌的50毫升猎鹰管胆道树，并用无菌剪刀切末。
- 添加少量的酶溶胶的ution到管＃1（约5毫升）和继续直言不讳胆管树浆的一致性，直到它到达。
- 浆料倒入无菌玻璃瓶。洗出余下的解决方案＃1隼管，再倒入玻璃瓶。在37°C孵育30分钟100转晃动。
- 通过烧杯覆盖的单层尼龙网（30微米孔径）过滤泥浆。
- 洗涤用酶液＃2网格网格上的任何组织剩余转移到无菌的玻璃瓶。启动解决方案的一半（25毫升）倒入无菌15厘米培养皿。小心地从烧杯中取出的网状网边缘，没有污染的中心区，然后反相网格和它浸泡在培养皿的解决方案，以消除任何剩余的组织网格。丢弃网。在培养皿中转移到无菌的玻璃瓶的解决方案。冲洗培养皿与REMA伊宁25毫升溶液＃2，并将其转移到相同的玻璃瓶。在37°C孵育30分钟100转晃动。
- 在此期间，滤液在烧杯中倒入50毫升的猎鹰管。在每分钟1600转（460×G）离心5分钟，在室温下。
- 吸媒体和悬浮颗粒在25毫升的解决方案＃3。
- 采取步骤5.5解决方案，并与30微米网覆盖到第二个无菌烧杯过滤。
- 丢弃网。在每分钟1600转离心5分钟，在室温下的滤液。吸液和悬浮沉淀用25毫升的解决方案＃3步骤5.7。
- 结合步骤5.7和5.9的分数，并在每分钟1600转离心5分钟，在室温下再次。
- 吸媒体和门户网站的成纤维细胞培养基在10毫升（10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，0.3％庆大霉素，0.2％fungizone的DMEM/F12补充）悬浮沉淀。
- 组织培养皿中的生存能力和板计数细胞。根据所需的应用程序，0.5至5×10 6细胞每10厘米的组织培养板是恰当的。从成年SD大鼠，我们通常会获得2至10万个活细胞。
- 更换培养基次日除去非贴壁的碎片。此后，每2天更换培养基。
6。代表结果
从成年大鼠肝脏中分离的主要门户网站的成纤维细胞在1，3和7天隔离后（ 图3）所示。请注意，这些细胞与成纤维细胞形态典型，被拉长。可染色细胞与抗弹性蛋白抗体（CL55041AP，Cedarlane实验室，伯灵顿，NC），以确认纯度。门户成纤维细胞进行培养的肌纤维母细胞分化。这可以证明α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA的A2547，西格玛，圣路易斯，密苏里州）的免疫。
表1。酶活性的解决方案。
图1。灌注成立。A。循环水变暖列。二柱含有灌注媒体。 C.旋塞阀控制泵流出。 D.泵流入。 E.变速蠕动泵。 F.与生物清洁洗涤剂保温瓶。 G.散热灯。 H.水洗澡变暖灌注媒体。
figu重2。 原位灌注。门静脉插入静脉导管，缝合和固定，通过活塞灌注管相连。 B.玻璃吸管连接到保温瓶和墙吸删除灌注液引流下腔静脉横断。一肠。属肝。
图3。相衬和免疫荧光染色培养的大鼠门户成纤维细胞培养后1，3，7天的隔离。门户成纤维细胞进行了固定和弹性蛋白，α-SMA和DAPI染色。
Discussion
门户网站的成纤维细胞发挥胆道纤维化的重要作用。在这里，我们描述了一个隔离大鼠肝门成纤维细胞，提供了一个简单的方法来研究这种细胞在体外人口克鲁格洛夫和Dranoff 8发表的原始协议的修改。
这种方法使用蛋白酶消化和规模为基础的过滤。该方法的主要优点是没有获得人口相对纯的细胞，可以通过在文化，使基因表达的研究或几天后隔离功能细胞的行为。这种技术还提供了隔离健康和患病的肝脏细胞的潜力。
在该协议中最关键的步骤之一是肝实质的酶消化。为了确保成功消化，重要的是确认在初始灌注肝脏血液已完全耗尽，锡安作出肯定，甚至有肝热烫。为了促进这一点，可以用棉签轻轻按摩肝脏，而灌注。消化肝实质结果在一个活细胞的产量低，而在消化将使其难以分开胆管树的肝实质。由于蛋白酶的筹备工作有可能需要在不同的地段，优化使用量之间的酶活性的变异时，有活菌产量低。
该协议可能会被修改为门户的成纤维细胞从小鼠肝或年轻大鼠肝脏隔离使用一个较小的计静脉导管，cannulate门静脉灌注液量，减少动物体重的比例，并减少肝脏灌注率约10毫升/分钟。
门户成纤维细胞培养，经过10-14天的肌纤维母细胞的分化，由α-SMA的前pression 9。肝星状细胞，包括fibulin-2，IL-6，弹性，以区别于门户网站的成纤维细胞已被用于各种标记核苷三磷酸diphosphohydrolase-2（NTPDase2），cofilin的-1和神经突触2，6，10，11，如蛋白质。我们发现弹性是一个门户网站的成纤维细胞的标记，甚至肌纤维母细胞分化后，，而NTPDase2丢失门户成纤维细胞后，经历了9几天后，文化。因此，我们通常确认为弹性蛋白免疫荧光染色门成纤维细胞的分离。
这项技术的限制后，立即门户成纤维细胞的分离，是有污染的细胞，包括Kupffer细胞和胆管细胞的一小部分。门户长大成纤维细胞会在2-3天内这些污染的细胞，然而，产生一个相对纯净的人口（98％）9。
硅，NCE文化门户的成纤维细胞进行组织培养塑料肌纤维母细胞分化，我们通常在7天的隔离研究这些细胞。细胞维持在含10％胎牛血清的媒体门户的成纤维细胞培养，在方法部分所述。然而，这些细胞就会生存含2％胎牛血清几天媒体的增长。我们通常不使用低血清培养基，直到隔离后至少24小时。一旦门户成纤维细胞进行肌纤维母细胞的分化，他们可以传代数次和保持肌纤维母细胞冷冻库存。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由国立卫生研究院以R01 DK05823（RGW），F32 DK083213（JWW），F30 DK081265（阿拉伯劳工组织），拨款和弗雷德“苏珊娜比泽克小儿肝病中心（RGW）从。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 | |
| Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 | |
| Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 | |
| Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 | |
| HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM | |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM | |
| Leibovitz's L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 | |
| Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |
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