Una técnica para aislar fibroblastos portales de hígado de rata se ha descrito. Los hígados se perfundieron y digerido<em> In situ</em> Con colagenasa, seguido por<em> Ex vivo</em> Digestión de la pasta de hígado y selección del tamaño de las células. Este método proporciona una población pura de fibroblastos portales sin la necesidad de pasaje en cultivo.
La fibrosis hepática se define por la deposición excesiva de matriz extracelular por miofibroblastos activados. Hay varios precursores de miofibroblastos hepáticos, incluyendo las células estrelladas hepáticas, fibroblastos portales y la médula ósea fibroblastos derivados 1. Las células estrelladas hepáticas han sido la mejor estudiada, pero fibroblastos portales son cada vez más como importantes contribuyentes a la piscina miofibroblastos, especialmente en la fibrosis biliar 2. Fibroblastos portales experimentan una proliferación en respuesta a lesiones del epitelio biliar, lo que podría jugar un papel clave en las primeras etapas de cicatrización biliar 3-5. Un método de aislamiento de fibroblastos portales permitiría estudio in vitro de esta población de células y conducir a una mayor comprensión del papel de los fibroblastos en la fibrosis portal jugar biliar.
Fibroblastos portal se han aislado mediante diversas técnicas, incluyendo derivación 6, 7 y Liperfusión ver con la digestión enzimática seguida por selección del tamaño de 8. La ventaja de la digestión y la técnica de selección de tamaño en comparación con la técnica consecuencia es que las células pueden ser estudiados sin la necesidad de pasaje en cultivo. Aquí se describe una versión modificada de la técnica original descrita por Kruglov y Dranoff 8 para el aislamiento de fibroblastos portales de hígado de rata que se traduce en una población relativamente pura de células primarias.
Portal fibroblastos juegan un papel importante en la fibrosis biliar. Aquí se describe una modificación del protocolo original publicado por Kruglov y Dranoff 8 para el aislamiento de fibroblastos portales de hígado de rata, proporcionando una manera sencilla para estudiar esta población de células in vitro.
Este método utiliza la digestión de proteasa y filtración tamaño basado. La principal ventaja del método es que una población relativamente pura de células puede obtenerse sin pasaje en cultivo, lo que permite el estudio de la expresión génica o el comportamiento funcional de células de varios días después del aislamiento. Esta técnica también ofrece la posibilidad de aislar las células de hígados sanos y enfermos.
Uno de los pasos más críticos de este protocolo es la digestión enzimática del parénquima hepático. Para garantizar una digestión éxito, es importante confirmar que la sangre se vacía completamente en el hígado durante el período inicial perfusiónsión, asegurándose de que no es aún escaldado del hígado. Para facilitar esto, es posible utilizar un hisopo de algodón para masajear suavemente el hígado, mientras que la perfusión. Durante la digestión de los resultados de hígado de parénquima en un bajo rendimiento de células viables, mientras que bajo-digestión hará que sea difícil separar el parénquima hepático del árbol biliar. Como los preparativos de pronasa una variabilidad en la actividad enzimática entre los diferentes lotes, la optimización de la cantidad utilizada puede ser necesaria cuando hay un bajo rendimiento de las células viables.
Este protocolo puede ser modificado para aislar fibroblastos portales de hígado de ratón o de hígado de rata joven mediante el uso de un calibre más pequeño catéter IV canular la vena porta, disminuyendo el volumen de las soluciones de perfusión en proporción al peso del animal, y la disminución de la tasa de perfusión del hígado a aproximadamente 10 ml / min.
Fibroblastos Portal de la cultura someterse a la diferenciación miofibroblástico en 10-14 días, como lo demuestra por el ex α-SMAdepresión 9. Diversos marcadores han sido utilizados para distinguir fibroblastos portales de las células estrelladas hepáticas, incluyendo fibulina-2, IL-6, elastina, los nucleósidos trifosfato diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), 1-cofilina y proteínas neuronales tales como sinaptofisina 2, 6, 10, 11 . Hemos encontrado que la elastina es un buen marcador de fibroblastos portales, incluso después de la diferenciación miofibroblástico, mientras NTPDase2 se pierde después de fibroblastos portales han sido sometidos a cultivo después de varios días 9. Por lo tanto, suelen confirmar el aislamiento de fibroblastos portales por la tinción de inmunofluorescencia para la elastina.
La limitación de esta técnica es que, inmediatamente después del aislamiento de fibroblastos portal, existe una pequeña fracción de contaminación de las células, incluyendo las células de Kupffer y células biliares. Fibroblastos portales se superan estas células contaminantes dentro de 2-3 días, sin embargo, dando una población relativamente puro (> 98%) 9.
Sina vez que los fibroblastos portal de la cultura someterse a la diferenciación miofibroblástico en plástico de cultivo de tejidos, por lo general estudian estas células dentro de los 7 días de aislamiento. Las células se mantienen en portal medios de fibroblastos de cultivo que contienen 10% de suero fetal bovino, como se describe en la sección de métodos. Sin embargo, estas células sobreviven en medio de crecimiento que contienen 2% de suero fetal bovino durante varios días. Por lo general no utilizan los medios de comunicación de baja de suero hasta por lo menos 24 horas después del aislamiento. Una vez fibroblastos portales someterse a la diferenciación miofibroblástico, pueden pasarse varias veces y se mantuvo como material congelado de miofibroblastos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el NIH R01 DK05823 (de pasarela residencial), F32 DK083213 (para JWW), F30 DK081265 (a ALO), y por una beca de la Fred y Suzanne Biesecker Centro de hepatología pediátrica (de pasarela residencial).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |